中間報告
ウズラ始原生殖細胞導入ニワトリキメラにおけるドナー細胞の追跡
ANSHIN HOSHINO
1.ニワトリは古くから実験発生学上の鳥類を代表とする主要な材料として用いられてきた。また、受精卵の入手が容易であり卵殻外培養（Perry et al.,1988）の開発により種々の胚操作が可能であることも特徴として挙げられる。
2.一方で胚が多量の卵黄や薄い卵黄膜に覆われている事や、受精から胚盤葉期までの期間で初期発生が卵管内で行われているため他の実験動物に比べ生殖細胞系譜の解析や胚操作、遺伝子改変技術の妨げにもなっている。そこで1個体に2つ以上の遺伝的に異なった細胞から構成されているキメラ個体を作製し解析していく事は、細胞の動態解析や個体の形態形成など知る上で生物学的に有効な手法である。
3.個体を構成する細胞には大きく生殖細胞と体細胞に分類できる。始原生殖細胞とは将来精子や卵子になることを運命決定されている細胞であり、次世代に遺伝形質を伝えることのできる細胞である。そこでウズラ始原生殖細胞導入ニワトリキメラを作製しドナー細胞を追跡していくことを目的とした。
1.効率的な始原生殖細胞移植キメラの作出の確立（ficoll濃度勾配遠心法）
現在作出されているキメラにおいて様々な細胞分離の方法が試みられている。
＠stage14から血液を採取してficoll濃度勾配遠心法や磁気分離法を用いて細胞を単離
＠生殖腺から細胞を解離してficoll濃度勾配遠心法で濃縮する方法
＠細胞を培養して移植する方法などがある。
本研究においてこれらの中で比較的簡便なficoll濃度勾配遠心法の改良を目指す？。
1-1 ficoll濃度勾配遠心法による最適な回収率は？
方法
1 sample/16%ficoll+6.3%ficoll (1000μｌ+200μl)
2 16%ficoll+sample/6.3%ficoll (1000μl+200μl)
3 16%ficoll+sample/10%ficoll (1000μl+300μl)
4 16%ficoll+10%ficoll +sample/10%ficoll
現在、比較的回収率の高いと思われる方法3または4を用いてPGCsの回収を行っている。原因は不明だが（多分Ficoll鮮度または、テクニック？）回収率にばらつきがある。
また、injectionを行った上での生存率についてもPGC回収方法およびinjectionの技術に左右されてしまう可能性がある。（少し生存率が低すぎ 3日齢で全滅等 60時間孵卵でstage14-5）
作出されたキメラ個体は雄2羽（うち性成熟個体1）のみ。 孵化直前個体1、孵化直前死亡個体および未性成熟死亡個体等はは生殖腺部位を4% パラフォルムアルデヒドおよびブアンで固定、パラフィンブロックにて保存中である。
2.異属間でのドナー配偶子形成の解析
現在、異種間ニワトリキメラで雌雄混在のPGCを雄以外に移植して作製された雄生殖細胞キメラニワトリにおいて、雌PGCが雌特異的なW染色体をもつ精子まで、分化することは明らかにされている。（Tagami.T
et al.,1997）一方で異属間へ導入された PGCも血流を介し背側腸間膜を通り生殖腺へたどりつき少なくともPGCの時期までは定着をしている。（Ono,
T.,1998）また、雌雄混在PGCが性成熟雄ニワトリにおいてＷ精子を産生している可能性をPCR法によっても示唆されている。（町田 陽子（1998）信州大学大学院農学研究科平成9年度学位論文）我々は異属間ニワトリキメラにおいて導入PGCが生殖細胞へと分化していく過程を明確にしていくために形態学的、分子生物学的手法をもちいて解析をしていく。
2-1-1 embryoの時期の解析
＠免疫組織による検討
mAb QCPNで雌雄ともにある一定条件であるが、13日齢ほどまで追跡が可能である。
6日齢キメラ個体における組織切片では,donor細胞（ウズラ）が観察できた。ただし、内因性のパーオキシターゼを持つrecipientのニワトリ血球細胞もDABによって可視化されてしまう。２次抗体の複合体形成を再検討するか、強引に形態で判断をする方法を用いれば
PGCからoogonia（recipientと同期化していれば8日齢）またはspermatogonia（recipientと同期化していれば13日齢）へ分化しているものを観察できるかもしれない。
一方、ヒメウズラは弱陽性を示したが、もう一度western 免疫沈降等を行えばはっきりとした結果が出るかもしれない。
＠PCRによる検討
本研究室で作られたprimerを用いてキメラ解析を行う
現在、controlでのみうまくいっているが、キメラ個体では条件設定を煮詰めている段階。
DNA10ng〜500ngで条件を振ってみる。。
chimese painted quail
quail genome specific primer
positive（quail）
quail and chick genome specific primer
negative? ( chick )
＠southern in-situ PCR in-situ hybridaization
probの検討 名大（松田先生）のもので同時に行いたいのだが。。。
参考文献がみつからない。
染色体でのFISH、southernはハイブリしないらしいが、組織内での細胞レベルの検出に用いることができるか？
2-1-2 減数分裂の過程において2倍体から半数体へドナー細胞は分化を行えているか？
キメラ個体が性成熟し始める時期なので精子のサンプリングをおこない。形態観察、
およびPCRを行う予定。しかし、PCRによってnegativeだったら・・・・・・・
おまけ
2-2-1 ドナー細胞の排除？
PGCは劇的に増殖および生存嚢の制御を受ける細胞である
→マウスの場合移動期から生殖隆起に定着した後数日間にかけては活発に増殖する。このようなすばやい増殖は周りの環境因子によって制御されている。
→生殖腺内で雄は減数分裂の休止期に入り雌は減数分裂前期に入る卵母細胞の場合1/3に精祖細胞も70%程に減少すると言われている。
→エラーを持った細胞を細胞を排除する機構として働いている可能性がある。
→鳥類の場合、性分化前後で頭部および背側腸間膜にPAS陽性細胞としてPGCが観察されている。キメラを作出していく過程においてドナー細胞と生殖腺以外のPGCや生殖腺内で細胞死を起こす細胞とに関連はあるのだろうか？
2-2-2 アポトーシスが起こっているか？
同種間生殖腺キメラにおいてセルトリ細胞におけるアポトーシスが示唆されている
w精子のspermatocyteにおいて分化の抑制を受ける要因として(セルトリ細胞のアポトーシスによる)細胞群の滑落が生じているらしい？
��.形態学的に一般染色、免疫組織化学を行い細胞の核の凝縮の有無の観察
��.w特異的cDNAプローブを用いたin situ hybridization
��.アポトーシスキットを用いた観察？
3性について
異性胚に移植されたドナー細胞は、ホスト胚の生殖腺内で雄では精子に、雌では卵子にそれぞれ分化を遂げる。すなわちドナーの遺伝的な性にかかわらずホスト側の環境に影響される。しかし、異性キメラにおいて胚盤葉キメラの場合♂→♀の場合、ホスト胚で性転換が起こっており、♀→♂の場合性転換はおこっていない。PGCキメラにおいて同様の結果がおこるか？今回
ゼミ
ABSTRACT
��WL→RhodeIsland Red chicken embryo
��stage13-15の血液を移植 残りの血液はドナーの性判別に用いた。
�Ｕ柩�17ｄにおける生存率 33.3％（homo-sexual）35.4％（heterosexual）
本研究で孵卵18ｄ以降は生存していない。原因不明
�だ舷Ａ�は孵卵18日以降で死亡個体および孵化直後から採取、形態学的観察
��PGC移植によるhetero-sexual embryoは体細胞と反対の性にも生殖腺が発生する場合があり、産生される配偶子も将来反対の性になる可能性がある。
INTRODUCTION
avian PGCs
epiblast→hypoblast→germinal crescent→circulate vascular system
→germinal ridge→differentiation(spematogenesis oogenesis)
近年
外来遺伝子をPGCに導入 (han et al., 1994a ; Naito et al.,1994a ;Inada1997
;
Eguma et al.,1999)
Chimeraの作製 (Pettie et al., 1990;Han et al., 1994b;Kagami et al.,
1995:
Ono et al., 1996;Yamaguchi et al., 1998）
異性Chimera (Tagami et al., 1997)
異性間でPGCをDonorからRecipientに移植したとき、PGCを含む生殖腺組織の発生の可能性を示した。
→もし、このことが可能ならばWまたはZを持つPGCsが異性生殖腺でもSpermatogoniaやovaになるかもしれない。。。
→生殖腺の形態学的 組織学的形態に焦点を絞って、異性間での生殖腺の発生を明らかにした。
MATERIALS AND METHODS
Donor PGCs
Rhode Osland Red chidkens 48-50h incubation
stage 13-15 の血流移動中からPGC採集
Recipient embryo
WL 受精卵
Donorと同様に孵卵
Recipient胚へのPGCの移植
採取した血液をペトリ皿に滴下→recipientから4-7μl抜血→同血管部位より移植→泡止め
＠窓あけ法（直径10mm）
＠パラフィルムで塞ぐ
＠1Donor→1recipient
Donorとrecipientの性判別
Donorのinjectionで余った血液とRecipientから採集した２μlずつの血液を
Extraction kit(Strage, Canada) でDNAを採取
w染色体特異的配列を用いてPCR（Clinton, 1994）
生殖腺の形態学的 組織学的解析
孵化個体および死亡個体の生殖腺はマクロ観察をして摘出→ブアン固定→パラフィン
→薄切→HE
統計 t-検定
RESULTS
81個体中 homo-sexual embryo→ 33
hetero-sexual embryo→48
17d以上生存→28（34.6％） table1
homo-sexual間でPGCの移植したとき、異常な生殖腺はみとめられなかった。
形態学的組織学的奇形はhetero-sexual embryoで認められる。
♂→♀の場合。（7例）
＠5例はrecipient側の生殖腺発生。
＠1例のみtestisに非常に似た生殖腺を形成（fig1)
＊しかしながらrecipientは移植PGCによっては卵巣が完全に退化されてはいない。
＠unclearな個体について
＊左側生殖腺がラグビーボールのような雌雄融合した生殖腺が形成 (fig2)
♀→♂（10例）
＠6例はrecipient側の生殖腺発生。
＠4例はabnormal gonads
＊右側生殖腺は正常発生
＊左側生殖腺はabnormal gonads（fig無し）
DISCUSSION
chimera chickenはすでに作製されている（Naito et al.1994a）
一般的にPGCは体細胞の性に依存している胚の性に従うといわれている。
→本研究で各々のenbryoの性がPGCの移植後に決定するということを明らかにした。
（mixed cell from male and femaleでは明らかにできなかった。）
PGC移植によるhetero-sexual embryoは体細胞と反対の性にも生殖腺が発生する場合があり、産生される配偶子も将来反対の性になりうるかもしれない
鳥類精子発生の概要
PGCは13-15日齢で急速な増殖期に入り精祖細胞に分化をする（swift,CH.,1916.oirgin of the sex-cord difinitive spermatogonia in the male chick. Am . J . Ant.,20;375-410）
分裂に際して生じる一対の細胞の一方が制し発生の過程に入る際に、他方は必ず以後の増殖と分化を担う間細胞として温存される
Clermont(1961)
幹細胞
微細なクロマチン顆粒とエオジン好性の中心域を示す殻を持ち、細胞質はグリコゲンを含みPas陽性
A型精祖細胞
幹細胞の分裂によって生じる細胞の内、精子発生の過程へ進むものは、ヘマトキシリンにそまりにくい、やや粗大なクロマチンの充満した核を持ち、細胞質はPas陰性である。
Ｂ型精祖細胞
ヘマトキシリンによく染まるクロマチンを核周辺部にもつB型精祖細胞でその分裂によって精母細胞に分化する（ハトではその中間型精祖細胞も存在している。）
精母細胞
当初はB型精祖細胞と同じように6−7μmの小さい核を持つが、まもなく細胞体も２倍ほどにおおきくなり、核の中に糸くず状の染色体が現れてくる。はじめは、繊細な染色体を持つ細糸期、のちに太く発達し、厚糸期となる。この時期の精母細胞核の特徴は、細胞分裂の前期の像に似るが核膜が完全に保たれている点で異なる。
次の分裂は成熟分裂と呼ばれmaturation division と呼ばれ、減数分裂meiosisとそれに続く第二次精母細胞（secondary spermatocyte）であるが此の細胞には１組の染色体（n=23） しか含んでいない。減数分裂につづいて間も無く第二の成熟分裂が起こり、精子細胞が生じる。結局１個の精母細胞は精子細胞（spermatids）4個をつくりその後は細胞分裂は起こらずに４個の精子となる。
精子形成（spermiogenesis）
精子細胞は丸いかくとその傍らにゴルジ装置および中心体を持ちミトコンドリアは、細胞周辺部にエオジン好性イディオソームと呼ばれる領域が現れることにはじまる。まもなく此の部分に濃染性の先体顆粒（acrosomal
granules ）と呼ばれる小球体が現れる。やがてゴルジ装置に由来する大きい小胞があらわれ、核の表面に押しつぶされたような形で密集して先体（acrosome）となる。先体の内宮は先体の顆粒を包み、pas
陽性で多糖類にとむ。先体は書くの表面を包むように広がり、扁平な頭帽（head cap）となる。これはやがて核のほぼ全半分をおおう。ゴルジ装置の残存部は次第に核の反対側へ移り細胞外に放出される。しかしながらはとにおいては、この遺残細胞質が成熟精子に残存し精巣輸出管内の精子においてもなお認められる
一方中心体は先体の反対側で核膜に接近し、近位中心子とよばれるものは核膜に平行し、遠位中心子と呼ばれるモノがこれと直交し、後者から鞭毛（flagellum）すなわち（axial
filament）がのびだしてくる。やがてべんもうをとりまく輪状の小体が現れてくる、これははじめ中心体に近く出現するが、次第に離れて中心体から一定の距離のところに位置する用になってくる。此の中心体と輪状小体の間の部分、すなわち中片部にミトコンドリアが集合し、鞭毛の周辺部に螺旋状に配列する。