ES細胞は試験管内で神経特性を表す

解剖学・神経生物学部、細胞生物学・生理学　ワシントン大学医学

集合体として培養し、レチノイン酸にさらすことによってマウスのES細胞は通常、神経と連合した多様な表現型を発現することを（酵素の合成を）誘導する。加工処理された集合体の多くは、豊富な神経の生長を発生させる。トリプシン存在下で誘導された集合体を分離したものや単分子層のように細胞を平板培養すると細胞の大多数の培養物が神経の出現を示すという結果になる。これらの神経様細胞はⅢ類のβ―チューブリンや神経線維Ｍサブユニットを発現させる。誘導された培養物は神経線維Lサブユニット、グルタミン酸塩受容体サブユニット、遺伝情報因子Brn-３、GFAPを含む神経の連合遺伝子ために遺伝情報を明示する。神経線維LやGAD67、GAD65遺伝子情報の数値は誘導により劇的に上昇した。神経のような細胞が潜在的活動を発生し電位依存性カリウムチャネルやカルシウムチャネルと同様にTTX感受性のナトリウムチャネルを発現させることが生理学的研究によってわかった。我々は神経線維発現の複雑な組織はES細胞の培養を活性化するという結論に達した。この組織は神経分化の調節するかなりの機構を研究するための有望なものになるだろう。

導入 ES細胞系は着床前のマウスの胚に由来するクローン細胞系である。ES細胞は2つの特性をもち、その組み合わせは哺乳類発達の分析のためにES細胞を強力な組織にする。はじめに、宿主の胚盤胞にある内部細胞の塊を注射するとES細胞は宿主の胚を組み込み、胚系を含むすべての細胞血統を構成する。結果的に動物、つまり分化した組織は被移植体とES由来細胞との混合物により作られる。ES細胞のこの特性は、分化全能性と名づけられる。第二に、ES細胞は培養中ほぼ無制限に複製することができる。さらに培養中250にもなるES細胞の複製物に全能性は残っている。ES細胞は全能性を失うことなく培養中に分裂するので、ES細胞は遺伝子操作の細胞に理想的である。外来のDNAは相同組み換えまたはランダムな挿入のどちらかによりES細胞に差し込まれうる。

ES細胞は発展途上である神経組織のすべての部分に細胞を与える胚内部細胞の固まりの中に移植された。発展途上の神経組織に移植されたES細胞がいつどのように連結するかの詳細は直接研究されていない。移植されたES細胞は普通の初期胚細胞の発達段階と同じように発達すると仮定した。通常の発達では内部細胞の塊が基本の外胚葉を成長させ胚の全細胞は細胞層から引き出される。原腸胚の過程を通して基本の外胚葉は外胚葉・中胚葉・内胚葉を成長させる。もとになる中胚葉の影響下にある中線外胚葉はおそらく神経組織を成長させる神経外胚葉になる。この経路に沿って主要段階を調節する機構を理解することは多くの最近の目標である。有益な接近の一つにES細胞の相同組み換えによる調節遺伝子の候補を不活化し、神経発達への影響が観察されたものがあった。このような研究によりWnt-1・Hox1,6・En-2・MASH-1遺伝子が神経組織の初期発達での重大な役割を果たしていることが分かった。　

これらの、またその他の調節遺伝子によるメカニズムをより明らかにするために、試験官内でES細胞から再構成されたり研究されうる神経細胞への経路のシステムを生むのに有利になるだろう。発展途上の神経についてのたくさんの基本的な疑問は現在の方法では答えられない。試験官内においてES細胞に組織の基礎をおくことはすでに言及されていて、ES細胞の遺伝特性に加えて様々な利益をもつだろう。まず経過に沿った重要な段階で、大半の細胞は単離できる。このことにより通常胚から見つかる有限の細胞において不可能であった生物学的分析を行うことが可能になるだろう。第二にこの経路の一連の段階により組織培養の環境を簡単に研究できた。細胞に影響を及ぼすこのような多くの外来要因は系統的に規制されたり変えられたりできる。ES細胞から造血細胞への経路は試験官内で再構成され、この研究方法を駆り立てる具体的例を提供する。　

ES細胞は試験官内で分化して様々な細胞タイプになりうる。分化を活性化するために胚性幹細胞と呼ばれる多細胞の集合体として成長するための非粘着性の層上にES細胞はまず培養される。約10日間培養され続けた胚性幹細胞は次に粘着性の層に移される。筋・心臓・神経・造血系の骨格を含む多様な細胞タイプは胚性幹細胞の副産物に分化する。神経様細胞は全細胞のほんの数％で他の細胞型にランダムに混ざり合っている。希少な神経様細胞はもとのES細胞を神経様細胞に分化する成長経路についての重要な研究での主要障害物である。この論文上で我々は神経の宿命を選択するES細胞の培養細胞の割合が上昇する可能性を調べてきた。我々の研究ではP19奇形がん細胞系を発見した。P19細胞とES細胞には共通の基本的な特徴がある。もっとも重要なのはES細胞に似たP19細胞は初期の胚に移植したときや試験菅内で多様な経路に沿って分化できることである。P19細胞はレチノイン酸の処理により神経経路に沿った分化をすることにより誘導される。レチノイン酸の処理を受けたES細胞由来の胚性幹細胞は多様な神経特性を表す細胞の割合を多く引き出すことを我々は発見した。その結果はES細胞やそれらの派生物の神経分化に関連性のある調節機構についての多くの実験に役立つ。

材料と方法

神経系

D3ES細胞神経系はS.Korseweyer医師によって発見された。 DDEfeederはES細胞神経系とは独立したものでGordon　kellerによって発見された。

培養状態

ES細胞分化の培養。ES細胞は0.1％のゼラチン溶液で上塗りした組織培養フラスコにより調整された組織培養の人工培基質であるゼラチンコート上で育てられる。細胞はRobertsonによって述べられたものと似た環境で培養される。基準の環境はDMEM(1-グルタミンと高濃度のグルコース。ピルビン酸はなし)と次に示すものである。胎児の牛亜科の血清10％・新生の子牛の血清10％・ヌクレオシドの貯蔵物。血清の多くは無作為に選ぶ。白血病を抑制する因子は基準の環境に1000unit/mlの完全濃縮と10⁻⁴㏖のβーメルカプトエタノールとを加えたものでES細胞の分化を防ぐ。もとの貯蔵物由来feeder細胞の数％はD3培養中に発現する。

分化の誘導について、ES細胞はレチノイン酸なしの集合体として4日間の培養とレチノイン酸存在下での4日間の培養からなる8日間の導入処理を前提としている。誘導し始めると分化したES細胞の貯蔵培養物が急速に成長しゼラチンの下塗りから細胞を取り除くために塩水に0.25％のトリプシンと1M㏖のEDTAを加えたものによってトリプシン処理される。分離した細胞浮遊物は個々の細胞と小さい凝集塊の混合物を与えるためにすりつぶされる。この浮遊中の細胞は正確に数えられない。しかしながら浮遊する個々の細胞を取り出すために荒く分離すると次の段階にとってよい集合体を作る能力をなくす結果になり、集合体を作らなくなる。誘導処理のための細胞投入量を標準化し、個々が融合するT25鋳型枠からの細胞の1/4が直径100mmの細菌使用の皿にLIFとβ⁻メルカプトエタノールなしの環境に10mlごとにまかれる。レチノイン酸存在のような変動性試験のときはいつでも、すべての培養において細胞濃縮のはじまりが平等であることを保証するために、個々のフラスコからの浮遊物を実験用に調整した培養物が使われ始める。細胞浮遊物は細胞が形作られた集合体が浮いている間２日間培養される。Mediumがかえられ、培養はさらに２日間続けられる。このときMediumがかえられ、この指示により5x10⁻⁷㏖のすべてトランス型のレチノイン酸が補充される。さらに2日後、Mediumは培養を処理するレチノイン酸を含む新鮮な環境と交換されるがもう2日間は調整や培養を続けるためにレチノイン酸なしで行う。

8日間の誘導期間の後、細胞接着基質を供給するために集合体は組織培養地に移動されている。約100個の集合体はLIFとβーメルカプトエタノールが欠乏した基準環境で2ml中35mmのくぼみの中にまかれた。これらの集合体の培養は本文の中で示すように続けられた。8日間の誘導期間が終わった他の実験での集合体はトリプシン存在下（EDTA中0.25％で10分間）で分離され、ラミニンコートされた皿に移植された。（35mm皿につき20μg）

抗体着色

クラスⅢβ―チューブリンを認識するモノクロナール抗体TuJ－１は細胞特異的な同形であるが、Anthony frankfurter医師によって発見された。神経線維のMサブユニットを認識するモノクロナール抗体３H11はGerry Shawによって発見された。培養物は2％のパラホルムアルデヒドで固定されて0.01％のトリトーンX-100で浸透性を与え、本来の抗体にさらしてさらに生物の小さな遅い抗マウスIgGにさらす。拘束された抗体は製造管理に続くVectastain　ABCシステムによって明視化される。

ＲＴ－ＰＣＲ分析

初めの構成要素であるcDNAを発生するために5μgのDnaseIが未分化のES細胞からまたはレチノイン酸処理下から全細胞のRNAを消化し、酵素供給によって誘導された実験に従い、6つのプライマーと逆転写酵素M-MLVが無作為に逆転写に使われて次の7日間で細胞を分化する。それに加えて、逆転写酵素が欠如した状態で行われた偽の反応はそれぞれのRNAに対してなされた。フェノール抽出とエタノール投下の後、それぞれのcDNA調整物は100μLの水に浮遊させられた。　

mRNAがGluR1-4とGlur6と対応するグルタミン受容体の検出のための条件となるオリゴヌクレオチドプライマーと最も効果的なPCR反応が発見された。GluR1-4プライマーははっきりとしかし密接に関係のある4つのmRNAを検出でき、それぞれのプライマーが分離したグルタミン酸受容体サブユニットを暗号化することに注目すべきだ。それゆえ、これらのプライマーを使って、一つまたはそれ以上のこれらのmRNAが存在するという決定的な結果がでた。Brain-3、チロシン水酸化酵素、神経コウ繊維の酸形成タンパク質、脳因子１mRNA検出のためのオリゴヌクレオチド対は発表する配列のもとになる。配列は次の通りです：Brn-3．．．．．

GluR6のためのアニーリング温度は55度まで上昇することを除けばGluR1-4とGluR6の検出のためのPCR反応は記述のように行われる。Brn-3、TH、GFAP、BF-1について、反応は1、5m㏖の塩化マグネシウムを含んだ酵素製造業者によって提供される基準のＰＣＲ緩衝液TaqDNAポリメラーゼをつかって行われる。オリゴヌクレオチドプライマーは１μ㏖の濃縮物の中にある。鋳型の1または5μLはどちらもそれぞれの反応に使われる。増幅の35周期は30秒間94度で、アニーリングは30秒間50度、プライマーの伸長は1分間72度の変性温度を使って行う。それぞれの反応の1/3は1、5％のアガロースゲルの負荷がかかり、PCR産物は蛍光性の次の電気泳導でエチジウムブロマイドによって検出される。

ＲＮａｓｅ保護分析

細胞ＲＮＡ全体は未分化のＥＳ細胞や記述のような平板培養で5-7日目の分化した細胞から単離された。Rnase保護分析はRNA全体の細胞の50μgと放射性同位元素を使って識別したアンチセンス（mRNAなどの遺伝物質の一部に対し相補的な配列をもち、遺伝子の働きを阻害する）RNAプローブ5X10cpmを使って記述のように行われる。GAD67とGAD65についてのプローブはすでに述べられた。マウスの神経繊維Ｌ鎖と一致する350塩基対のcDNAプローブはオリゴヌクレオチド・・・・を使ったPCRによって発生する。このcDNAは基準の方法によりpBSⅡSK+ベクターの中に組み込まれ、その同一性を確立するために配列される。

電気生理現象

ES細胞の培養物は１分間に1～2mlの割合でTyrode溶液(・・)にばらまかれる。すべての細胞を記録するためのピペットはボーラルのキャピラリーから引き抜かれ、sylgardの膜で覆われる。内部溶液は（・・）に含まれるナトリウムとカリウムの流動を記録するのに使い、７０ｎＭの自由なカルシウムを与えるために（・・）による記述のような準備がされる。開口した先端抵抗は1～5Mohmに変化する。薬物溶液はマイクロキャピラリー菅の配列を使った細胞に応用される。外部溶液の変換のための不断の時間はおよそ30～50m秒である。興奮性と抑制性のアゴニストは（・・・）の中に溶かされる。

電位依存性カルシウムチャネルの流動は電荷の運び屋であるバリウムを使って記録される。外部溶液は（・・・）である。大多数の実験のではピペットは（・・）で満たされている。同様の結果は（・・）で満たされたピペットを使っても獲得される。流動はAxopatch200拡大鏡で記録され、1～5KHzにろ過され、10から20KHzにデジタル化される。流動の痕跡は保持潜在能力から8～10mVの過分極段階によって生じる流動を測ることにより漏出量と収容力として補正される。直列抵抗に対する部分的な補正は大多数の実験で使用される。もし残り一連の抵抗のためにおこるボルト数の間違いが5mVより大きかったら、もしこれらが最大限の過渡電流の明白で鈍感な成分だったら、あるいはもしこれらが内部のナトリウムやバリウムの流動のはっきりした境界だったら細胞は量的な分析から拒絶される。膜組織潜在能力は証印が形作られる内部溶液とTyrode溶液の間の接合潜在能力に対して記録されてきた。この潜在能力はCsCH₃SO₃を含むピペットに対して-10mV、一方CsFとCsCl溶液の接合潜在能力に対しては‐7mVである。流動はアゴニストの塗布が保管と分析のために圧縮されている間に平均0、1～1秒間に情報の３msecずつ記録された。もし他の点で注意しなければ結果は標準誤差±を意味するようにはっきりしている。すべての実験は室温で行われた。

結果

上で述べたように、胚本体を作ることによる分化のためのＥＳ細胞の誘導は神経様細胞が細胞の数％を構成する異種の培養物であるという結果になる。神経の誘導環境を発達させてみた中で我々はＰ１９奇形がん系を発見した。簡潔にいうと、レチノイン酸存在下で４日間集合体としてＥＳ細胞を成長することはＰ１９細胞に対してなされたような実在する神経の誘導という結果には至らなかった。しかし、この行為のとは異なったものが成功した。

ES培養においてレチノイン酸は神経様組織をもつ細胞の出現を刺激する

D3ES細胞の未分化の貯蔵物はLIFとβーメルカプトエタノール存在下のゼラチン培養基の上で育ち、それは分化を抑制することで知られている環境である。実験が遺伝子的に正常な、発達的に分化全能性のES細胞で行われることを確実にするために生殖細胞系伝達のキメラマウスを作り出すことを用いてきたD3系の単離が使われた。誘導が行われているときも細胞がまだ分化全能性をあるということを確実にするために誘導は解凍した標準的な貯蔵物の継代１０番目の範囲内で行われる。

未分化のES細胞は標準環境で非粘着性の皿で培養される。これらの環境のもとだとES細胞は皿の表面に接着しないし、すぐに集合体の浮遊物を形成する。はじめの２日間は、集合体は不ぞろいな輪郭で小さい。4日目までには、集合体はより大きくなり、大部分は球状をなしている：大きく出現する集合体の表面で細胞は目立つ。最も成功した神経誘導はさらに4日間5x10⁻⁷Mのすべてトランス型のレチノイン酸存在下状態にあった集合体の4日間の培養で獲得された。レチノイン酸の濃度はP19細胞の結果をもとにして選択される。：他の濃度の影響は研究されていない。つまりこの実験は4+/4-処理に関連する。対照実験については4日目の集合体がさらに４日間レチノイン酸なしの状態で培養された。：これらは4-/4-集合体に関連していた。

4-/4+や4-/4-の実験から誘導された細胞はどちらもレチノイン酸を欠いた標準環境の中で組織培養の下地の上で完全な集合体として平板培養された。一日以内で大半の集合体を表面に貼り付け、表面に緻密に付着した扁平細胞の細い輪で取りまいた。4-/4+と4-/4-集合体は出現のときに区別できる。さらに数日後、集合体を取りまく扁平細胞の輪は拡大し、培養皿の底で多くの集合体が平らになりそして広がり始めた。3日間の平板培養によって4-/4+と4-/4-集合体の間に顕著な違いがあらわれた。4-/4+集合体の多くは神経の完璧な生長を生じた。それとは対照的に4-/4-集合体にはほとんど神経の生長はなかった。

神経の生長は次の3日間でより複雑になり4-/4+と4-/4-集合体の間の違いは劇的に残った。写真１は蒔いてから6日後の典型的な4-/4+集合体を示す。神経の生長は集合体の境界線に沿って多くの部分で生じる。神経の生長がかなり広範囲に及ぶこと、密集した形成をなすこと、神経の収集物がからみあっていることが高精度の写真によって示される。神経発現に伴う多くの細胞もまたこれらの生長の中で見つけられる。レチノイン酸処理が神経生長の範囲を上昇させるということを証明するため、神経生長があってもなくても総数は集合体の数から成っている。D3細胞系に対するこれらの観測は4-/4-と比較したとき、4-/4+集合体は7、8倍も多く神経の生長をする。同様の結果はES細胞系から独立したCCEfeeder でも得られる。ここでは4-/4-集合体と比べて4-/4+集合体は6、8倍も多くは神経の生長をする。

上記の結果はES細胞は試験官内で神経の形態学を表現するために誘導されうるという結論を強く支持している。しかし、それらは２つの事柄に従属している。我々が利用する初めのD3貯蔵物は細胞分裂を妨げることが明らかにされてきたfeeder細胞を含んでいた。これらの細胞の数は継代により劇的に減少した。しかし、feeder細胞がすべての貯蔵培養物の中に存在するために発現するものもほんの少しだがこれらの実験の中で使われた。とても不幸であるにもかかわらず、この少数のfeeder細胞が我々の実験結果の負担になる可能性もある。二番目の事柄は、これらの結果がD3細胞にとっては有効かもしれないが他のES細胞系にとってはそうではないかもしれないということである。我々はES細胞のCCE系のfeeder独立亜系を使って実験を繰り返すことによってどちらの事柄にも取り組んだ。この亜系は造血系血統の細胞に分化する能力をもち、それゆえ大規模な分化潜在能力をもっている。しかし、それは胚系のキメラを作るために論証されてきた。それゆえ全能性ではないかもしれない。上記に示したように、CCE細胞は4-/4+実験を誘導するためにD３細胞と似たような方法で反応する。 feeder細胞が存在しないのでこの観測はfeeder細胞がレチノイン酸との反応に必要ではないことが示された。それらはまたレチノイン酸が第二ES細胞系の神経の構成を刺激するということも示した。

完全な集合体を編成した結果、それらが任意の培養基で編成された後の4-/4+集合体中で広範囲にわたる神経分化が存在することが示された。誘導された細胞のより詳細な写真を得るために我々は集合体に編成前トリプシン処理をするという実験を実行した。準備段階の実験はラミニン酸で覆われた培養基が培養物を改良させることを示した。4-/4+集合体が培養皿の上でトリプシン処理されると、大部分の細胞はすばやくラミニン酸で覆われた培養基に付着する。培養物は2日目までに、培養基に緻密に付着した平板細胞の母集団と神経様細胞からなる。神経様細胞はそれらから出現したさまざまな長さの神経に対して小さな細胞体を持っている。ほとんどの神経様細胞は平板細胞の表面に広がっている。神経様細胞数は神経様細胞が2日目に母集団の約38％からなるということを示した２つの実験中の平板細胞と関係する。対照的に4-/4-培養物はほとんど神経を示さなかった。さらに3日後、平板細胞は融合性の単分子層を形成するために分離する。神経様細胞はこの層の表面に残っている。これらの細胞は大きな細胞体を持っていて、神経の大規模な連絡網を形成する。4-/4-集合体からの培養物は主としてほんの少しの神経を持つ平板細胞からなる。

分散した細胞培養物を使ったこれらの実験によりレチノイン酸はES細胞の集合体における神経発現に対して細胞を誘導する強い反応をもつということが確立された。それらはまたレチノイン酸の誘導後、細胞のとてもしっかりした画分が神経通路に沿って分化しうるということを論証した。

神経様細胞による神経タンパク質の発現

神経様細胞や突起が神経連合タンパクを含むかどうかを決定するために、培養体はクラスⅢβチューブリンやNF⁻Mに対する抗体に染色される。これらのタンパクの発現は神経を大いに制限する。CCEES細胞系の集合体は4-/4+処置やそのときの編成により完全な集合体として誘導される。編成から7日後、培養体は固定され、染色される。ある培養集合体の領域は神経の様細胞が別々にまたは小さな塊で発生するために平板化されてきた。大部分の神経のような細胞はクラスⅢβチューブリンに対する抗体で染色された。塊からの神経出現もまた染色された。多くの単一化した細胞もまたNF⁻Mに対する抗体によって染色された。抗体に染色されない、またはとてもかすかにしか染色されない神経様細胞もある。これは神経様細胞の集団を制限するNF⁻Mの発現や抗体の感受性を低下させるためでもありうる。塊からの神経の出現はNF⁻Mに対する抗体によってはっきりと染色される。両方の抗体での染色は背景細胞染色の欠如や標準なマウス血清染色の欠如によって鑑定する多大な特性である。培養体がD3系から誘導されてきたということで同一の結果が獲得されてきた。このシステムは神経を発現し、また2つのタンパクを発現する細胞や神経が通常、神経を連合させると我々は結論を下した。

ES培養での神経遺伝子の発現

この経路のさらなる特徴を述べるために、我々は分化前後のES細胞にある神経遺伝子の発現を試験した。まず実験の道具だが、7日間の培養で編成され持続されてきた未分化のES細胞や4-/4+集合体から単離されたRNAはRT⁻PCRによって分析された。CNSの中で選択的に発現された転写因子Brn⁻3の発現は未分化細胞と分化した細胞両方から検出された。

対照的にチロシン水酸化酵素に対しての遺伝情報、GluR1⁻4・GluR6クラスのグルタミン受容体サブユニット、GFAPはES細胞の分化の中でのみ検出される。我々のPCR分析は量的なものではないが、結果は少なくとも少数の神経遺伝子の発現が試験管内での分化を促すことを増加させることを連想させる。おもしろいことに、神経システムの前の部分で選択的に発現する転写因子BF⁻1の遺伝情報は、これらの環境で誘導されなかった神経遺伝子もあるということが提案された未分化の細胞でも分化した細胞でも検出された。

より詳細にES細胞の試験管内での分化中における神経遺伝子発現を研究するために、軽鎖神経繊維、GAD67、GAD65遺伝子の転写値は分化誘導前後にリボヌクレアーゼ（RNAの加水分解を触媒する酵素）タンパク分析で測定された。NF⁻Lは主として神経の中で発現する繊維発現の中間体である。だが一方GADはGABAを合成する酵素であり抑制性の神経に局在している。未分化のES細胞の中でさえ多くのNF-L発現物質がある。未分化のES細胞による他の神経遺伝子発現は観察されてきた。全部で3つの転写値は我々の誘導環境により強烈に跳ね上がった。驚いたことに、レチノイン酸が誘導中に存在している期間は細胞が誘導後に集合体として編成される時間と同じくらい長いかどうかをいとわずに３つすべての測定値はupregulateされた。もし、細胞が誘導後に分散されるなら、レチノイン酸処理集合体からの唯一の培養物はGAD遺伝子から発現する。目だったことに、NF-L遺伝子の発現はたとえ後半部分が神経様細胞をほとんどもっていなくても4-/4+,4-/4-誘導両方から培養物を分散させるのを増加させる。この結果はこれらの細胞内にある調整の複雑なシステムを論証した。

分化したES細胞の電気生理学的性質

ES細胞の電気生理学的性質はトリプシンによって分離され、ラミニン酸で覆われた培養基の上で編成された4-/4+集合体から調整された分散した培養物で研究された。全細胞の記録は編成から1～11日間45個の細胞から得られた。この期間中、神経様形態学をもつ細胞は比較的少ない保持電位-70～-100mVの伝導性をもっている。入力抵抗は初めの5、6日間で最も高くなる。より分化した細胞はいくらかより高い容量とより低い入力抵抗をもっている。編成から5日後までの全神経様細胞が変偏光除法電位段階で刺激を受けたときの内・外部への電位依存性ゲートの電流を表した。類似の電流は早くも分化後24時間後には検出された。しかし16中3つの細胞はあまり、もしくは全く内部電流を表現しない初めの4日以内に試験した。活動電位は24中21個の細胞で偏光除法電流の注入によって導き出された。細胞形態をもつ細胞の特性に対して平板培養細胞4つからの記録は高度な未増殖の入力伝導力と電位依存性の電流の形跡を表した。
神経様細胞のために内部電流の初めの注入は0、5～1μ㏖テトロドトキシンにより完全に閉鎖された電位の制限のもとに記録された。このことは電位依存性ナトリウムチャネルがこの電流に従うということを提案した。表6CはTTX感受性の電流が11個の異なった試験電位で記録されたということを示す。電流が最大に達するときの試験電位が‐50～約‐10mVの最高流動と失活した割合とが滑らかに上昇するものもあった。編成してから初めの5、6日間に最大のナトリウム流動は検知されない‐1000pAより大きく変化した。より分化の進んだ細胞はより大きい電流を発現するために表れた。しかしこれら多くの細胞に対して十分な電位制御を保証することはできない。TTX感受性の流動が不活性化した不変状態は3つの細胞で試験された。：半不活性化を誘導する電位は‐63±2mVだった。TTX存在下で外部流動は‐30mVとそれ以上の試験電位の段階に対して観察された。+40mVでの不変状態の流動はKCH₃SO₃またはKFを含むピペットで150～1200pAに変化した。セシウムを含んだ内部溶液は全部の細胞の記録が確立された後、初めの数分間でその大きさにおいて鋭い減少を誘導するのでこの流動は膜電位依存性カリウムチャネルにより仲介されるかもしれない。

興奮性・抑制性アゴニストに対する感受性のために２７個の細胞を我々は試験した。編成後9、10日目までの流動は次の化合物の１つまたはそれ以上によって神経の形態をもつすべての細胞に誘発された。；カイニン酸、NMDA、GABA、グリシン。この時期のすべての細胞は4つのアゴニストすべてに感受性がある。編成後4日目の細胞4つのうち2つは4つのアゴニストのうち少なくとも１つに反応した。一方、分散培養物がどの化合物にも実質的に何も反応を示さない初めから4日目の5つの細胞を試験した。編成後9日目に記録した図7Aのグラフは流動が数秒の継続適用に対して腐食がほとんどなくなることが示されたカイニン酸やNMDAによって活性化されている間、数秒の時間進行を越えて脱感作したGABAかグリシンによって引きおこったということを示している。GABAやグリシンによる流動門のマイナス保持電位の大きさは内部溶液の構成に強く依存している。大きな内部電流は内部溶液が高濃度の塩化物イオンを含んでいたときのみ観察された。記録は-60～-80mVでGABAまたはグリシンを適用している間、主要な内部アニオンがほとんどもしくは全くない流動を示したようにフッ化メタンや硫化メタンに対して成功した。しかし、0～40mVを保持している間これらのアゴニストに対して大きな脱感作外部流動が観察された。それとともに、これらの結果によりＧＡＢＡとグリシンが活性化塩化物浸透チャネルであるということも得られた。

流動はこの試験中で使われた内部溶液のすべてに対して0mVに近い極性を逆転させるカイニン酸やNMDAによって活性化される。この細胞は適度のNMDAへの反応に関係をもつ表7Aに示した。しかし多くの場合に流動はカイニン酸のそれと大きさが比較できるNMDAによって制御される。NMDAによる流動制御の条件領域間、カイニン酸流動の大きさを示す-70mVの保持電位は-410±90pAである。

DISCUSSION

この研究の結果、普通神経細胞と連合しているそれぞれの多様な表現型の発現をしている細胞中で培養中にES細胞が分化可能であることが示された。最も効率のよい誘導は4日間集合体として培養している幹細胞によって得ることである。そのとき、さらに4日間集合体をレチノイン酸にさらす。★集合体は粘着性培養基の提供の上でこの進行と完全な編成をすることによってあれらが脳細胞の主要な培養を観察していくのと似た完璧な神経の成長を誘導する。細胞誘導された集合体が単一の細胞に分化したり編成したりしたとき、それらの培養物には2つの主要な細胞タイプがあるという結果になった。平板細胞は基礎環境や平板培養の表面で成長している神経様物質が発現した細胞と関係している。これらの培養物は神経の若い主要な培養物と似ている。神経様細胞が神経線維のMサブユニットやクラスⅢβチューブリンタンパクを発現するES細胞に由来するということが抗原染色によって示される。多様な遺伝子はタンパクをupregulate する酵素合成発信機や受容体サブユニット発信機や細胞骨格のサブユニットを含む基本的な神経機能と連合するための遺伝番号を発現する。分化したES細胞の電気生理学の特性もまた神経のような表現型に対して強い証拠となる。編成してから数日以内で神経伝達物質の多様性に対する受容体の機能と同様、実際にすべての神経形態を持つ細胞が電位依存性Na+・K+とCa2+チャネルを発現させる。はるかにたくさんの実験が分化した細胞中の多様なチャネルのサブタイプを同一化するために必要であろうけれども、強い電気的興奮と発信機の感受性の発現は細胞の小規模な部分集合に限られていないが、特徴はいっぱいに広がっているということを我々の初期の特徴付けが明らかに論証した。全体として考えれば、形態学的、免疫学的、分子学的、生理学的なデータは少なくとも、神経分化に使われた遺伝子の規則的経路の部分集合が培養中にES細胞を活性化するということを主張する。神経の発現型の発現レベルがかなり高いということに注目するのは重要なことである。4-/4+集合体の分離によって培養物中の細胞の約38％はそれらの形態に属す神経様細胞であるであるということがわかった。両方のGAD遺伝子の転写不変状態レベルは分化で劇的に上昇した。また、誘導中の培養物は成熟したマウスの脳の中でそれらのおよそ10％であった。同じようにNF-L転写も高い。

これらの将来有望な観察にもかかわらず、神経のようなこれらの培養物中での神経発現で細胞分類することはまだ早いだろう。★シナプスの形成能力を持っているような標準神経のある基本特徴は制限された神経伝達物質の表現型の発現や神経のよく特徴付けられた部分集合の形態の発現をまだ記録していない。さらに、神経コウの最近の研究によりほかの細胞型と同様に電位と発信機依存性のチャネルを含む神経タンパクの多様性の発現がかつて考えていたよりさらに広いということが発見されている。これらすべての理由に対して我々は真の神経というよりは神経様細胞として分化した細胞をあらわすことが重要だと考える。

この研究は試験管内での神経様細胞までの経路について、３つの結論から裏づけている。はじめに、神経様細胞は完全な胚とは違った環境でES細胞から分化しうる。ES細胞は内部の細胞塊にある着床前の細胞を表現すると信じられている。普通の発達では、これらの細胞は初期の外胚葉と呼ばれる細胞層を形作り続ける。初期外胚葉はこのとき原腸形成の外胚葉・中胚葉・内胚葉を生長させる。★★外胚葉は中胚葉との相互作用なしで神経分化が可能であるということは、キイロショウジョウバエで示されてきた。胚様体の造血系・心臓性経路を含むほかの主要な系統が活性化されるということを発見したことから、胚様体にある神経経路を活性化する能力は首尾一貫したものとなっている。

これらの研究からの２番目の結論はレチノイン酸が多様な分化全能性の早期胚性肝細胞の発現を導く経路を活性化しうるということだ。誘導間のレチノイン酸の存在ははっきりした影響を２つ記録した。集合体は誘導間にレチノイン酸にさらされ、そして標準集合体よりももっと上段階で神経突起を発現する完全な集合体としてまかれる。また、レチノイン酸処理された集合体から得られた細胞は分離されて編成され、それらは高割合の神経様細胞からなる培養物に分化する。標準物はとても少ない神経様細胞で作られたレチノイン酸にはさらされなかった。これらの結論はほかの最近の研究から得られた証拠によって首尾一貫したものとなる。培養体の中にあり、たくさんの分化した神経へ導く細胞のもととなる前駆細胞の多型潜在性の複製と生存をレチノイン酸は促進する。それは聴覚の有毛細胞の再生も刺激する。有毛細胞とは高度に分化した蝸牛上皮からの細胞の形態のことである。レチノイン酸は培養中に神経伝達物質のpostmitotic神経の表現型を管理し、培養中に光受容器へレチナール前駆細胞の分化を促進する。両生類脊椎動物の胚由来神経突起の生長はレチノイン酸によって刺激される。最終的に、レチノイン酸は神経経路に沿ってP19細胞の分化を誘導する。この影響でレチノイン酸が発揮するメカニズムは、大調査分野の問題である。レチノイン酸をつなげる２種類の受容体は、レチノイン酸受容体とレチノイドX受容体であるがこれらは同一化されていない。分析の詳述はまだなされていないが、RARsと暗号化されたmRNAはES細胞の中に存在し、レチノイン酸処理によってそれらのいくつかの発現が誘導されうる。ES細胞はまたかなりの量のRXRαとRXRβを発現するがRXRγの写しはほとんど発現しない。これらの受容体がES細胞を神経分化に導く経路において活性化されることを結論付けることは重要である。

これらの研究の最終的な結論は培養中のES細胞において神経表現型の発現を制御するシステムが複雑であるということだ。これらの発現は神経遺伝子の遺伝情報の発現と形態学的な表現型の間を分ける。簡潔にいうと、未分化のES細胞と、また平らな神経ではない細胞で発現されたNF-L遺伝子は編成前の分離された4-/4-誘導体に由来する。同様に、誘導された細胞を集合体や分散した細胞として蒔くとき、レチノイン酸処理された集合体は形態学的な表現型を完全に発現するために必要である。しかし、単独な集合体は細胞を集合体として編成するためのNF-LとGAD遺伝情報を誘導するのに十分である。全体として考えれば、これらの結果はレチノイン酸と細胞同士の連結がこのシステムでの分化において主要な影響があるということを示したがそれらはNF-L、GAD遺伝子が異なって神経の発現を管理するということも示した。

内部細胞塊から神経を発生させる組織へ導く通常経路が問題を解決する主体になることを経路の関係は正当に描写した。ES細胞が遺伝学的に標準でレチノイン酸が普通の細胞に効果をもたらす前細胞を持っているので、それらは多分、この試験管内での経路のいくつかの成分が試験管内での神経分化の責任の正確なモデルとなる。ツメガエル属のカエルでの最近の証拠では神経分化を抑制する信号の媒介としてのactivinタイプⅡ受容体に強い影響を与えた。この受容体による信号抑制は神経分化を導く。P19細胞内では、activin受容体に対して似たような役割を果たす証拠を連想させる。Activin受容体はES細胞において神経分化で似たような役割を果たすかもしれない。この役割は哺乳類の多分化性細胞とツメガエル族のカエルの胚によって共有される神経分化の共通の特徴に対する証拠になるだろう。他方では、標準神経システムで神経へ導く制御システムの構成は試験管内のシステムの中で失われたり変化したりする。神経様細胞由来のES細胞と実際の神経との間の共通点と違いについてさらに学ぶことは重要なことだろう。