現在、使用可能なシーケンサーは、
理学部のゲルシーケンサー（ABI373S）
キャピラリーシーケンサー（ABI310/rapid）
コラボ棟のキャピラリーシーケンサー（ABI310/long）
の3台である（コラボ棟のキャピラリーシーケンサーの使用には、使用登録が必要）。
目的に応じて使い分ける必要がある。
また機械ごとにサンプルの調製の仕方が少しずつ異なるので、注意が必要。
シーケンスに用いるサンプルは、ジデオキシ法を元に調製している。
サイクルシーケンス用のPCRのキットとして、DNA sequencing Kit（BigDye
Terminator Ready Reaction）が使用できる。
DNA sequencing Kit（Dye Terminator ready to reaction）は、コラボ棟のキャピラリーシーケンサでのみ使用できる。
通常の場合はBigDye terminatorを使用することをお薦めする。
（1）Sequence reaction
BigDye TerminatorでもDye terminatorでも共通のプロトコルである。
| Terminator Ready Reaction Mix | 4 |
| Template | |
| dsDNA（0.2ug/ul） | 1 |
| PCR product（10~30ng/ul） | 1〜3 |
| Primer（3.2pmol/ul） | 1 |
| DDW | up to 10ul |
注：この反応系はメーカー推奨の半分量で行っている。
これまでの経験から、total volume 10ulで十分解析可能なピークを得ることが出来ている。
（2）Dye Terminator cycle sequence（PCR）
以下のプログラムを用いる。
|
25 cycle |
（3）EtOH precipitation
BigDye terminatorの場合
1）0.6ul tubeにサンプルを移し、3M NaOAc 1ulと95%
EtOH 25ulを加える。
2）室温で10分静置した後、14,000rpmで20分遠心。
3）70% EtOH 200ulでリンス後、スピンダウン。
4）真空乾燥。
Dye Terminatorの場合
1）0.6ul tubeにサンプルを移し、3M NaOAc 1ulと99% EtOH 25ulを加える。
2）氷上で10分静置した後、14,000rpmで20分遠心。
3）70% EtOH 200ulでリンス後、スピンダウン。
4）真空乾燥。
（4）Buffer suspension
1）ゲルシーケンサーで泳動する場合は、
34cmのゲル板を用いる場合は3.5ul
48cmのゲル板を用いる場合は3.0ul のSample bufferに懸濁する。
懸濁後、熱ショック（90℃ 2min）して急冷し、泳動に用いる。
sample buffer：50m EDTAと脱イオン化ホルムアミドを1：5の割合で混合した溶液。-20℃で保存。
2）キャピラリーシーケンサーで泳動する場合は、添付のTSR buffer 20ulに懸濁する。
懸濁後、熱ショック（95℃ 2min）して急冷し、泳動に用いる。
ゲルシーケンサーを使う場合はゲルシーケンサーの使用法へ
キャピラリーシーケンサーを使う場合はキャピラリーシーケンサーの使用法へ
Sequence reactionに関して
1）シーケンス後の波形データでピークが弱いときはTemplateの量を増やしても良い。
増やしすぎるとPrimerではなくTemplate同士でアニーリングする可能性が高くなるような気がするので、私の場合は2.5ulあたりを上限と考えている。
2）Template量を増やしても改善されない場合は、Templateの精製などを疑った方が良いと思われる。
ちなみに私の場合、大量にシーケンスを行う必要がある時は、
ミニプレプ後のサンプル50ulにRNaseAを1ul加える
→タッピングして混ぜたサンプル1ulをシーケンスのTemplateに使用
残り50ulは-20℃で凍結保存 とかしている。
上記の方法は、あまりオススメはしないが、フェノクロ/エタ沈の手間が省ける。
リアクション中にRNAは分解されるらしく、ピークも綺麗に出る。
Dye Terminator cycle sequence（PCR）に関して
とくにTipsなし。
EtOH precipitationに関して
1）BigDye terminatorの場合
95% EtOH の使用と、室温で静置することは必ず守ること。
99% EtOH を使用した場合や、氷上でエタ沈した場合、蛍光ラベルされたdNTP mixや短鎖の反応物が必要以上に沈澱し、Backgroundが高くなる。
2）BigDye terminator、Dye Terminatorに共通して
70% EtOHのリンスは丁寧に行うこと。
雑に行うと、
i）上記のケースと同様に、蛍光ラベルされたdNTP mixや短鎖の反応物が必要以上に沈澱し、Backgroundが高くなる。
ii）十分に脱塩されず、サンプルバッファーが高塩濃度となり、泳動時の波形が歪む。
などの弊害が起こりうる。
Buffer suspensionに関して
ゲルシーケンサー、キャピラリーシーケンサーに共通して
熱ショックは、アニーリングした1本鎖DNAを解離するためのステップである。
急冷しないと再びアニーリングしてしまうので、必ず90℃/95℃を保った状態から氷上に移して急冷する。
文責：平滑王