用意するもの
・大腸菌株
・L ブロス（1L）
・滅菌DDW（1.5L）
・20%グリセロール溶液（20〜30ml）
・10%グリセロール溶液（2〜3ml）
・液体窒素（〜3kg）

準備するもの
・遠心管の滅菌
・冷却遠心機の確保

1）大腸菌を2xTYに接種して終夜培養。
　2.5mlずつ、2本分培養する。

2）終夜培養した大腸菌液を1LのLブロスで培養する。
　0.5LずつのLブロスを3Lコルベン2本に分けて、ウォーターバスで培養するとよい。

3）37℃で2〜3時間培養後、OD=600で吸光度を測定。
　0.5〜1.0で培養を止める（0.7〜0.8くらいが良いか？）。

4）培養した大腸菌溶液をコルベンごと氷冷（〜30min）。

5）500mlの遠心管2本に移して、4℃, 5,000rpmで15min遠心。

6）集菌された大腸菌をそれぞれ500mlの滅菌DDWで洗い、再び4℃, 5,000rpmで15min遠心。

7）集菌された大腸菌をそれぞれ250mlの滅菌DDWで洗い、再び4℃, 5,000rpmで15min遠心。

8）集菌された大腸菌を20〜30mlの20%グリセロール溶液に懸濁し、再び4℃, 5,000rpmで15min遠心。

9）集菌された大腸菌を2〜30mlの10%グリセロール溶液に懸濁する。

9）50ulずつ0.6mlチューブに分注し、液体窒素で瞬間凍結して-70℃で保存する。

Lブロス 　Tryptone　　　　10g 　yeast extract　　5g 　NaCl　　　　　 　5g 　5N NaOH　　　　0.5ml 　DDW　　　　　up to 1L 　3Lコルベンに0.5Lずつ分注。 　綿せんしてアルミホイルでカバーし、オートクレーブ。

10％グリセロール溶液・20％グリセロール溶液 　グリセロールを10％（v/v）あるいは20％（v/v）でDDWに混ぜ、オートクレーブ。

　

文責：平滑王