ブロッティング

　　メンブレンは絶対に素手で触らないように！

１　タッパーにBlotting Bufを入れ、濾紙を二枚浸す。

２　メンブレンを濾紙二枚の上に置き、その上にゲルをのせる。

３　最後に濾紙を一枚重ねる。濾紙をピンセットで押さえ、気泡を押し出す。

４　濾紙一枚の方が陰極側（黒）を向くように泳動槽にセットする。

５　泳動槽を氷水で冷やしながら、60Vで30分間ブロットする。
　　電圧と時間の条件はブロットしたいタンパク質によって変化する場合もある。

６　ピンセットでメンブレンを取り出し、ゲルの隅を鉛筆でマークしてから、ゲルを除く。

７　メンブレンをタオルペーパー上で軽く風乾させる。

８　余分なメンブレン部分をメスでカットし、0.01% Ponceau3R-5%酢酸溶液で染色（振盪）。
　　染色時間は約10分間。バンドが見えるまでは染色する。

９　メンブレンをタオルペーパー上で軽く風乾させる。
　　分子量マーカーなどがあれば鉛筆でマークした後、完全に風乾させる。

１０　メンブレンはタオルペーパーに挟んで保存可能。

検出反応

１　ブロッキング
　　ブロッキング液（5%スキムミルク-TBS）にメンブレンを浸し、室温で15分〜ゆっくり振盪する。
　　もしくは、4℃、o/nでもよい。ブロッキング後、TBSで軽くリンスする。

２　一次抗体
　　一次抗体を0.5%スキムミルク-TBSで希釈する。（最終希釈率：1/5,000〜1/50,000）
　　ブロッキングしたメンブレンを抗体希釈液に浸し、室温で1時間、ゆっくり振盪する。
　　もしくは、4℃、o/nでもよい。

３　ウォッシュ
　　タッパーで、TBSで10分間、TBS-Tで10分間、TBSで10分間、室温で激しく振盪する。

４　二次抗体
　　二次抗体（HRP標識抗ウサギIgG抗体）を0.5%スキムミルク-TBSで1/5,000に希釈する。
　　ウォッシュしたメンブレンを抗体希釈液に浸し、室温で一時間、ゆっくり振盪する。
　　もしくは、4℃、o/nでもよい。

５　ウォッシュ

６　検出
　　Detection Reagent (ECL)の1と2を等量混ぜた溶液を作る。（通常1ml+1ml）
　　タオルペーパーで軽く水分を切ったメンブレンを溶液に浸し、1分間インキュベート。
　　余分な溶液を手折るペーパーで除く。
　　カセットにサランラップを張り、メンブレンをのせ、その上にサランラップを張る。

７　露光＆現像
　　暗室で、電気を消した状態（安全ランプはON）で、フィルムをセットする。
　　露光（30秒〜5分。抗体反応の強さによって異なる）
　　現像。

写真が真っ黒、もしくはところどころに黒い染みが見える

　ブロッキング不足、ウォッシュ不足、一次抗体が濃い、ECLが多い、露光時間が長い、メンブレンが乾燥して余分なタンパクor抗体が張り付いてしまった、などの理由が考えられる。
　メンブレンは絶対に乾燥させない。特に一次抗体、二次抗体の時は、メンブレン全体に溶液が行き渡っているかをこまめに確認すると良い。溶液量は、正方形の検出用プラスチックケース（CBBで使うものと同サイズ）であれば10ml、小さな長方形のサイズのものであれば5mlあれば恐らく大丈夫。ただし、o/n処理する場合、若干多めに溶液を調製すると良い。

写真が真っ白

　一次抗体が薄い、抗体が失活している、ECLが死んでいる、露光時間が短い、などが考えられる。

ECLについて

　ECLの1と2（黒キャップと白キャップ）は混ぜると反応が進む。オリジナルは絶対混ぜないこと。また、検出反応は酸化還元反応なので、オリジナルのキャップはきっちりとしめておく。

現像機

　現像機は使用30分前に電源を入れておく。具体的には最後のウォッシュを行い始めてから入れに行くと良い。もしも先客があって、現像機が使えない場合は、ウォッシュを終えた状態でメンブレンをTBSに浸して待つ。検出反応を行うと後戻りができないので注意。

H女史が作製したものをTが改変