固定
1. NGM2〜3枚（直径9cm）に培養したYA〜AdultをM9（3ml程度）で50 ml tubeに洗い集める。
2. 上澄みを捨て、M9を加えて約20〜30分間、室温で静置する。
3. 線虫を1.5 ml tubeに移し、1,500 rpm, 30秒間の遠心によりM9で３回洗浄する。
4. M9を除き、約100 ulの線虫に対して500 ulの4% formaldehyde solutionを加える。
5. 4℃でo/n〜24時間静置する。
6. PBS (pH7.2)で3回洗浄する（1,500 rpm, 30秒間の遠心）。
＃固定時間は観察したい蛋白質によって変わる。
＃洗浄後、PBSに浸した状態で4℃で１ヶ月間保存可能。
β-ME処理
1. PBSを除き、1425 ulのβ-mercaptoethanol buffer（β-MEを除いた溶液）を加える。その溶液に新しいβ-mercaptoethanolを75
ulを加えて、良く混ぜる。
2. チューブの蓋をパラフィルムで封をして、37℃で２時間〜o/n振盪する。
3. PBS (pH7.2)で3回洗浄する（1,500 rpm, 30秒間の遠心）。
Collagenase処理
1. 900 ulのCollagenase bufferを2 mg collagenaseの入った1.5 ml tubeの中に入れ、良く混ぜ、Collagenase
solutionを作成する。
2. 900 ulのCollagenase solutionを加え、37℃で激しく30分間〜２時間振盪する。
（30分ごとに実体顕微鏡下でチェックする）
3.線虫の1〜2割がバラバラになったら、氷上で30分間静置して反応を止める。
4. PBS (pH7.2)で3回洗浄する。（各10〜20分間）
抗体反応
1. 0.6 ml tubeに10〜20 ulの線虫を分注する。
2. Antibody diluted solutionを50 ul加え、室温で30分間反応させる。（ブロッキング）
3. Wash solutionで10分間洗浄する。
# オリジナルプロトコールにはブロッキングの操作はないが、バックグラウンドが高い抗体の場合はこの操作を入れている。
4. 希釈した一次抗体を50 ul加え、20℃でo/n〜24時間反応させる。時々ピペッティングする。
# 抗体の希釈濃度は各抗体によって異なる。目安はWBの100倍。ネガティブコントロールの血清では1/50を使用している。
ちなみにTNC-1抗体で1/5、RyR抗体は原液抗血清。
5. Wash solutionで3回洗浄する。（各10分間）
6. 1/5〜1/20希釈した二次抗体を50 ul加え、遮光して37℃で1〜２時間反応させる。30分ごとにピペッティングする。
# Rhodamine-phalloidin (stock 1mg/ml=2U/ul)は最終濃度10 ug/ml=0.02U/ulになるように二次抗体とともに加える。
# DAPI (stock 1mg/ml)は最終濃度1 ug/mlになるように加える。二次抗体反応終了30分前に加える。
7. Wash solutionで3回洗浄する。（各10分間）
8. 10〜15 ulのPhenylenediamine solutionを加えた線虫をスライドグラスにのせ、カバーグラスをかける。余分な水分を取った後、マニキュアでシールする。
検鏡に関するTIPS
FITC（緑）は蛍光が強く組織もはっきり見える。一方、Rhodamine、TRITC（赤）はFITCに比べて蛍光が弱い。
しかし、緑のフィルターでは線虫の自家蛍光（腸の中の大腸菌）や、GFPの蛍光も同時に出てしまう。
そのため、便秘などで腸に大腸菌がたくさんいる虫や、腸の周辺の組織を染色するとき、また、GFPを発現する虫を染色する場合は、二次抗体にRhodamine
(TRITC）を用いると良い。
Rhodamine (TRITC）での染色は自家蛍光のバックがほとんどないため、画像処理ソフト上で明度、コントラストをかなり上げることができ、結果的に蛍光の弱さを補うことができる。
Solutions
| 0.2 M PO4 buffer (pH7.2) | 1 liter | |
| KH2PO4 (FW: 136.09) | 8.06 g | 59 mM |
| Na2HPO4 (FW: 141.96) | 19.99 g | 140 mM |
| DDW | to 1 liter | |
| 4% formaldehyde solution | 25 ml | |
| paraformaldehyde | 1 g | 4% |
| DDW | 12.5 ml | |
| Heat to 60℃ and add 2〜4 drops of 1N NaOH. Heat until clear and cool down. |
||
| 0.2 M PO4 buffer (pH7.2) | 12.5 ml | 0.1 M |
| Store at -20 ℃ | ||
| PBS (pH7.2) | 1 liter | |
| NaHPO4 | 8.53 g | 60 mM |
| NaCl | 9.6 g | 164 mM |
| DDW | to 1 liter | |
| Adjust the pH to 7.2 with HCl. | ||
| β-mercaptoethanol buffer | 50 ml | |
| 1 M Tris-HCl (pH6.9) | 6.25 ml | 0.125 M |
| Triton X-100 | 0.5 ml | 1% |
| DDW | 40.75 ml | |
| Add 75 ul of ｧ-mercaptoethanol (final 5%) to 1425 ul of this buffer. | ||
| Collagenase buffer | 50 ml | |
| 1 M Tris-HCl (pH7.5) | 5 ml | 100 mM |
| 1 M CaCl2 | 50 ul | 1 mM |
| DDW | to 50 ml | |
| Add 2 mg of Collagenase type IV (SIGMA) for the final unit of 1000U/ml to 900 ul of this buffer. | ||
| Antibody diluted solution | 50 ml | |
| BSA (Alubmin, Bovin) | 250 mg | 5 mg/ml |
| Triton X-100 | 0.25 ml | 0.5% |
| PBS (pH7.2) | to 50 ml | |
| Wash buffer | 50 ml | |
| BSA (Alubmin, Bovin) | 150 mg | 3 mg/ml |
| Triton X-100 | 0.25 ml | 0.5% |
| PBS (pH7.2) | to 50 ml | |
| Phenylenediamine solution | ||
| phenylendiamine | 10 mg | 1 mg/ml |
| Glycerol | 9 ml | 90% |
| PBS (pH7.2) | 1 ml | 10% |
| Store in the dark at -20℃. Caution: phenylendiamine is carcinogenic ! |
||
| DAPI (NACALAI, 110-34) | ||
| Phodamine-phalloidin (Eugene, USA, R-415) | ||
| FITC-conjugated anti-rabbit IgG (DAKO, F0205)
[Green fluorescent] TRITC-conjugated anti-rabbit IgG (DAKO, R0156) [Red fluorescent] |
||
| Zeiss Axioplan 2, Ramp 100 W. | ||
Ref. Weinshernker et al. (J. Neurosci. 15(10):
6975-6985. 1995)
McIntire et al. (Neuron 8: 307-322. 1992)
文責：Dr.Hが作製したものをTが改変