・9cm plate (2-4枚)で増やしておいた線虫をM9 bufferで集める。

　

・DWで洗った後、できるだけ水分を取り除く。

　

・液体窒素を入れた乳鉢に線虫を入れて、すりつぶす。

　

・すりつぶした粉状の線虫をスパーテルですくいとり、1.5mlチューブに移 す。

　

・線虫250ulあたり750ulのTRIzolを加え、20℃で5分静置。

　

・線虫250ulあた り200ulのクロロホルムを加え、ゆっくり混ぜた後20℃で15分静置。

　

・13000rpm、4℃で15分遠 心。

　

・上層を新しいチューブに移し、線虫250ulあたり500ulのイソプロパノールを加えて 20℃で10分静置。

　

・13000rpm、4℃で10分遠 心。

　

・上清を捨てて75%エタノールで洗う。

　

・vortexをかけた後、7000rpm、4℃で5分遠心。

　

・上清を捨てて1時間ほど自然乾燥させる。

　

・DEPC waterに溶かした後、65℃で10分処理。

　

電気泳動

　TBE bufferでRNA用のアガロースを用いて行う。sample bufferもRNA用のもの。ただしこれらは全て組成は通常のものと同じ。

　

保存

　3倍量の99%エタノールを加え、-80℃で保存。

　

　これを再度使用する際にはエタノール沈殿を行う。

・1/10量の3M NaOACを加え、氷中で5〜10分静置。

・1400rpm、10分遠心。

　

・上清を捨てて5分ほど自然乾燥。

　

・20〜30ulのTEを加えて65℃で溶かす。

　

・試薬

　

　DEPC (diethyl pirocarbonate) treated water

滅菌DW	1l
DEPC	0.2ul

この後、滅菌

　

・諸注意

　

　RNAの分解を防ぐため、使用するガラス器具や乳鉢は 乾熱滅菌器で滅菌する（180℃、2時間）。プラスチック器具はエタノールで滅ロ。操 作中は使い捨て手袋を着用し、サンプルに唾液などが入らないよう、なるべく話をし ないようにする。

　

　液体窒素の中で線虫を軽くつぶした後、液体窒素がな くなったら良くすりつぶす。最初から勢い良くすると線虫が飛び散ってしまうので注 意。これを何度か繰り返す。

　

　保存は2、3日ならばDEPC water中（-80℃）でもかまわない。

文責：ADA