cDNAの合成

　・RNAase-freeの1.5mlチューブに線虫RNA（〜1mg)を入れ、13.5ulになるようにDEPC waterを加える。

　

　・70℃、5分処理。その後氷中で2分静置。

　

　・buffer、primerなどを加えた後、42℃、2分放置。

5× reaction buffer (with 15mM MgCl2)	5ul
0.1M DTT	2.5ul
10mM dNTP mix	1ul
RNase inhibitor (25 units〜)	1ul
anti-sense primer (2.5pmol)	1ul

　・1ulのSuperScriptII RTを加え、ゆっくり混ぜる。

　

　・42℃で30分反応。（上 手く合成されないようなら、1時間くらいに延ばしても良い）

　

　・70℃で15分放置。

　

　・スピンダウンした後、55℃に置いておく。

　

　・1ulのRNaseHを加え、55℃で10分反応。

　

cDNAの回収

　エタノール沈殿、真空乾燥をして回収する。

　

PCR

　回収したcDNAを鋳型としてPCRを行う。 （PCRの 項参照）

　

　

※この後、もう一度PCRをして増幅させた後sequenceを 行うとよい。

　

・注意

　

　使用するチューブやチップは全て滅菌をし、ケース自 体も素手で触らないようにする。

　

　RNAをの分解を防ぐため、使い捨ての手袋を着用して 実験を行う。

　

　合成されるcDNAはanti-sense鎖であることに注意。合 成の際に用いるプライマーはそれを考慮に入れる。

文責：ADA