１塩基多型、SNP(single nucleotide polymorphism)を持つハワイ産CB4856を用いて、PCR、制限酵素処理を行い組換え 率を計算することで、変異体の原因遺伝子をマッピングする方法。

　

1. primerの設計

　

　・PCRして500〜1000bpくらいの大きさになるように設 計。

　　SNPに関するデータ（位置や使用できるprimerな ど）は　

　　 http://genome.wustl.edu/projects/celegans/index.php?snp=1　

　　を参照。wormbaseにも記載あり。

　

　　例えば第１染色体のSNP、W03D8(position -5.6)について調べる場合

　　　cgaacttttatccgtcaccg

　　　caccccaattaatctgtgcg

　　を利用。

　

　・最初はどの染色体にあるかを決めるため、以下の SNPについて調べる。

染色体	SNP	position
LGI	W03D8	-5.6
	VF39H2L	2.94
LGII	Y51B9	1.44
LGIII	F56C9	-0.72
	ZK1098	0.5
LGIV	D2096	3.7
LGV	C13D9	-2.3
LGX	F45E1	-0.76

　　

　・染色体を決定したら、各染色体の両端について組換 え率を調べる。

染色体	SNP	position
LGI	F56C11	-19.75
	T07D10	13.69
LGII	T01D1	-18
	F15D4	13.4
LGIII	T17H7	-26.33
	Y75B8A	15.77
LGIV	Y66H1A	-24.93
	Y105C5	14
LGV	F36H9	-18.9
	F38A6	25.19
LGX	F11D5	-11.1
	C33G3	15.42

　・染色体のおおよその位置が決まれば、さらに細かく SNPを調べてマッピングを進める。

　

2. 虫の交配、回収

　

　・目的の変異体とCB4856を交配させる。

　

　・F1を一匹ずつ個別のプレートに移す（10〜20匹くら い）。

　

　・F2の中から変異体の表現型を持つものを一匹ずつ個 別のプレートに移す。

　　（このプレートを１つのlineとして組換え率を算出 するので、多いほうが確実性が増す。）

　

　・コントロールとしてN2とCB4856も増やしておく。

　

3. DNAの回収、PCR

　

　・1.で回収した虫がプレート一面に増えた後、lysis buffer(ProK 100 ug/ml)を400 ul入れて1.5 mlチューブに回収。

　　　（大腸菌が気になるときはM9 bufferで３回ほど洗ってやると良い）

　

　・虫を入れた1.5 mlチューブを55℃でO/N処理。

　

　・これをテンプレートとして1 ulをPCRに使用。

※PCRがうまく行かないときはEtOH ppt.をするか、テンプレートを希釈して加えると良い。

　

　・EX Taqを用いてPCR。

条件

94℃	15 sec.
56℃	1 min.
72℃	1 min.	以上を35 cycle
72℃	10 min.

　・制限酵素処理。

　　PCR産物に制限酵素とbufferをtotal 20 ulになるように加える。

※場合によってはover nightで処理をする。

　

4. 組換え率の計算

　

　・3.で制限酵素処理したサンプルを泳動。その結果、 バンドパターンがN2型かCB4856型かを見て、表を作ると簡単に調べることができる。

　

　　例

line/SNP	F56C11(-19.75)	W03D8(-5.6)	VF39H2L(2.94)	T07D10(13.69)
1	C	C/N	N	C
2	C/N	C/N	N	N
3	C	C	N	C
4	C	N	N	C

C: CB4856型　　N: N2型

　

　　上の例からすると、目的の遺伝子はN2型の多く現れ るVF39H2Lの近傍にあると考えられる。

　

　・１つのSNPが決定したら、次は近傍にあるSNPを使っ て、さらに解析を進める。

文責：ADA