大腸菌 - WE ARE X

WE ARE X

大腸菌

kuru - 2000年10月12日 13時11分27秒

大腸菌のTransformation

１、市販のcompetent cell
（competent＝【生物】　反応能をもつ．）　（東洋紡がよい）を使う。－80℃で保存しておく。製品はその辺にいるＥ.culi（「大腸菌」以後Ｅ.culi）よりもＤＮＡの取り込みが良い。Ｅ.culiは－80℃では死なない。－80C保存なら、３ヶ月ぐらいは、competent
cellとして使える。－80℃から出して、途中で一回でも暖かくなると、DNAを取り込まなくなるので、冷凍室から取り出す作業は迅速に行うこと。
２、これを氷上で溶かす。20分くらいかかる。1本につき100μｌ入っている。50μｌあれば十分なので2本に分ける。分けるチューブもあらかじめ氷上に立てて冷やしておく。
３、 Vector　DNA（Vector＝【遺伝】　ベクター　他のDNA断片を組み込まれて，細胞中で自律的に増殖できるDNA）　を1μｌ入れる。穏やかに指先でタッピングして混ぜる。このときVortexするとＥ.culiが壊れるので絶対にしないこと。
４、氷上に30分放置。この間にE.culi表面上にDNAが付着。
５、 42℃で40秒処理する。（heat
shock）ＤＮＡをＥ.culi細胞内に取り込ませる。40秒という時間は製品によって違うが（その製品のＥ.culiが一番DNAを取り込みやすい時間）正確に測ること。ちなみに取り込むＥ.culiは10万個に一個ぐらい。
６、再び氷上に1分置いて冷やして、heat shockを止める。
７、ＳＯＣ培地（あるいはLB培地）を使ったcompetent cellの8倍量を加えて穏やかに混ぜる。これは増殖の栄養源である。
８、 37℃で1時間保温。この時間が長びくと過程5で抗生物質に対する耐性をもったＤＮＡを取り込んだＥ.culiが体細胞分裂してしまい最終的にコロニーが多くできすぎてしまい、　コロニーが密集しすぎたり、出来るだけ多種の遺伝子を組み込んだ、コロニーを得ようとするときには、問題となる。大腸菌が下に沈んでいるので、緩やかにタッピングして、均一液とする。アンプシリン(抗生物質)100μｌ/ｍｌ入りの円形ＬＢプレートに一枚につき100から200μｌの大腸菌液を撒く。手を入れる前にアルコールで消毒すること。Spreaderで液を均一に広げる。Spreaderはエタノール溶液の中につけておいた物をバーナーで消毒して使う。広げる前に培地の端のほうで冷ますこと。エタノール液に火が燃え移らないように注意すること。この過程でＥ.culiに触れたチップなどは小さなビニール袋に入れて口を閉める。アンピシリン耐性のＥ.culiを研究室にばら撒かないよう注意すること。
９、 37℃(空気インキュベーター)で一晩保温（約、１２時間）。翌日コロニーが生じるはず。時間がたつとコロニーが大きくなりすぎてしまうので、４Ｃに保存する。

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