Aggregation

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Aggregation dishの作成

  1. φ30mm dishにPipetmanで20μlずつのWhitten's mediumの小滴を5つ作る。操作しやすいように、どちらかの端によせておく。
  2. Darning needleの先端を良く拭っておく。 Whitten's mediumの小滴のうち中央の一つを除く4つにそれぞれ5つずつ、 同様に片側によせてDarning needleで穴を作る(Darning needleは鉛筆のように握る)。 十分に深いdimpleを作成する。
    Aggregation dish
  3. Dishに静かに3.5ml mineral oilを重層する。Incubatorへ。
    Aggregation dish

透明帯の溶解・aggregation

  1. φ30mm dish (FALCON 1008)にTyrode's solution 60μlとWhitten medium 60μlの小滴を2つずつ作り、 3.5ml mineral oilをdispenserから静かに重層する。
    Tyrode's in dish
  2. Incubatorから卵を取り出す。実体顕微鏡で観察。 8 cellもしくはcompactionに発生した卵を20個(あるいは一度に処理できる適当な個数) mouth pipetteでとり、Tyrode's sol.(の周辺)に並べる(なるべくmediumを持ち込まない)。
  3. すぐに透明帯が溶けるので、卵をpipetteでWhitten's mediumの小滴に移す。周辺部に並べるようにする。 (卵がくっつきやすいので注意)
  4. Dishを静かに回転させるようにゆすって卵を洗う(卵が中央に寄る)。
  5. もう一つのWhitten's mediumの溜りを使って同様にもう一度卵を洗う。
  6. 透明帯を除去した卵をaggregation用dishの穴に1個ずつ移す。
  7. ESの懸濁液の上部・中央部・下部からそれぞれ100μlずつとり(ちょうど良いESの濃度が 得られるよう)、φ 30mm dishに液滴を作成する。mineral oilを重層。
  8. 5分ほどESが沈むのを待ち、回転させるように揺すって 混入しているFeeder(大型の細胞)を中央に集める。
  9. 実体顕微鏡で観察しながら、ESだけをなるべく濃い濃度になるようにmouth pipetteに吸う。
  10. Aggregation plateのdimpleに15-30個のESを加えてゆく。この作業の最中からESのclumping が見られる。
  11. 振動・衝撃を与えないようにaggregation dishをincubatorに移す。Incubate O/N。
  12. 翌日blastocystに発生した初期胚を子宮移植する。

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