DNA抽出

24 well plateのすべてのwellsのmediumが黄色くなるまでincubateする(増殖に差がある場合、500μl ESMを適宜追加してゆく)。
Aspirate medium, wash with PBS once
100μlずつTrypsin-EDTAを加える
37℃、2min incubate後、Dishを叩いてsuspendする。
900μlずつESMを分注してゆく
それぞれのクローンについて500μlずつ2枚のgelatin coated 24w platesに分注する(数回の経験では、1mlのcell suspensionのうち500μlを新しいgelatin coated plateに移し、残りを元のdishに残しておく、という方法でうまくいっている)。
適宜500μlずつESM (PFMでもOK。ESMで分化を抑制した方が増殖が早い)を追加しながら、well全面にESが増殖するまでincubateする。

Wash with (nonsterile) PBS once
Pour 500μl of DNA lysis buffer(50mM Tris-Cl pH8.0, 0.1M NaCl, 1% SDS, 20mM EDTA+1/20vol. 20mg/ml proK) onto cells
Seal plates with Parafilm
incubate at 55℃, O/N. (rotate gently at ca. 30rpm)
先太1ml pipetteで6連tubeにlysateをtransfer (Genome prepperを使う場合)。
Genome prepperの試薬3, 4, 5, 6 (DNA抽出用の試薬番号は3, 4, 5, 7になっている。試薬7には500μlのRNAse Aを加える) をGenome用のものに取り替える。1回試薬をdrainしてwash。
Tissue DNA, Program 4で開始する。試薬をもう一度drainするところから始める(計2回)。
3h44m。
DNAを先太チップでエッペンに移す(終わった後放置していると乾燥してしまうので注意)
55℃、rotate 30/minでincubateしDNAを完全に溶解する。