採卵

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準備

MWM 9ml in 15ml tube, ES FCS 1ml in 1.5ml tube, 0.22μm filter

1. FCSをMWMに加えinversion
2. 10ml syringeにとりfiltrize; 5(10)ml syringe 1本, 2.5ml syringe 1(-数)本(flushing用)に18G needleから直接移す。 5ml syringeに18G needleをつけてincubatorへ。
3. φ30mm dish (FALCON 1008)に5ml syringeでWhitten mediumの小滴を作り、 2.5ml mineral oilを静かに重層。Incubatorに入れておく。
4. 2.5ml syringeに特注品の30G needleを 取り付けてincubatorへ。

採取

とりあえず位相を揃えるため、全部の卵を採取しaggregationの際に8 cell、compactionを選別する。

　　
1. Mouth pipetteの準備。
2. Reuseのdishのふたにmediumの小滴を作る(卵管・子宮を採取して置く)
3. Mouseを頸椎脱臼で屠殺。
4. 腹部をアルコール綿で拭う(1:こうすることで毛が抜けてじゃまになりにくくなる)。 腹部に水平に鋏で切開を加え(2)、腹部の皮膚を上下方向に裂く(3)。
   
5. 腹壁正中に切開を加え(4)、左右に拡大する(5)
   
6. 腸管を頭側へよけ(1)、腎(2)のすぐ尾側に脂肪組織に包まれるように存在する 卵巣(3)、卵管(4)、子宮(5)を確認する
   
7. (右利きの場合)左手の鑷子で卵管から離れた部分の子宮をつまみ、 右手の鋏で卵管周囲の結合組織を剥離する。 卵巣と卵管の間の結合組織(1)を糸のように細くなるまで剥離し、この部分を左手の鑷子でつかみ直す。 子宮と卵管の接合部(2)に続いて卵巣と卵管の間(1)を切断し、卵管を取り出し、dishのmediumに入れる。
   
   両側の卵管を取り出した後、子宮を取り出すために子宮周囲の結合組織をなるべく剥離(3)し、 頸部で子宮を切断し取り出す。これもdishにとる。
   結合組織を十分剥離しないと赤血球や脂肪滴で卵が発見しづらくなる。
8. 卵巣と子宮を採ったdishを実体顕微鏡下におく。低倍率で観察する。
9. まず卵管内の卵から回収する。卵管采(1)を探し、 鋭5鑷子(3)とmediumを入れた2.5ml syringeにつけた30G needle(4)で転がすようにして (卵管に傷を付けないように)、卵管采が30Gの方向を向くようにする。30G needle(4)を卵管采(1)に挿し入れ、 入れた部分を鑷子(3)でつまみ、約5秒間mediumで卵管をflushする(あらかじめピストンに指をかけておく)。 うまく行った場合卵管内の粘液などが押し出され、内部が明るく見えるようになる。 失敗した場合などは子宮側の断端(2)からflushしても良いが、この場合やや手技が困難になる。
   
10. 子宮も両側の卵管の断端(または子宮の上部に直接30Gを刺しても良い)から内部をmediumでflushする
。
11. Medium小滴内にある受精卵をmouth pipetteで回収し、 あらかじめ準備したdishのmediumにとる。
12. 一通りの採卵が終わったところで、卵を選別する。 顕微鏡の絞りを拡げると死んだ割球が黒っぽく見えるので、このような割球を含む卵は除く。 Incubatorへ。

先端が丸めてある。100% EtOHから鑷子で取り出してキムワイプで拭い、 少しmediumでflushして使用する。 詰まるので使用後はすぐに洗ってエタノールを通しておく。

採血用毛細管を火であぶって左右に引き延ばして中央を切って作る。あらかじめ作り置きしておく。 細くなった部分の太さが一定で(引き延ばしたとき下にわずかに曲がる程度)、 ある程度の長さがあるものが使いやすい。 使用する際に断端が直角になるように整形し、ライターの火であぶって角を丸める。 Mouth pipetteの出来が作業の能率を左右する。

Airとmediumを2-3mm毎に交互に5-6回(pipetteの太さなどにより加減する)吸い、ブレーキとして利用する。

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