Electroporation

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1. ES : φ6cm dish 4枚。3枚あれば大体OK。confluentに近いと2枚で足りる。
2. 2時間前にESMでメディウム交換し、ESを観察
3. Warm PBS, Trypsin, ESM。氷箱とcuvetteを用意
4. Aspirate medium, wash once with 3ml of PBS
5. Add Trypsin-EDTA 0.5ml / dish, 37℃ 2min
6. ESM, 14ml tube準備, count準備
7. Dishを叩いて細胞をほぐす
8. ESM 1.5ml / dish 加え１枚に集めてsingle cell suspension 3-4回
9. 14ml tubeに集めてcount。1x 10⁷ cellsをtubeに残して残りはdishの上に捨てる
10. 700rpm 5min。DNA準備（例:500ng/μl x 50μl）
11. Cuvetteを氷箱から取り出して準備
12. 900μl ESMにblue tipでsuspend (900μl ＝ 1000μl - 50(DNA volume) - 50(pellet volume))。
13. DNAを加える。blue tipでよくsuspendしてcuvetteにtransfer
14. On ice 5〜10min
15. 270V, 330μF, low Ωでelectroporation (電圧が速やかに低下すること、mediumが泡立つことを確認する)
16. RT 5min。この間にESM 24ml準備
17. 細胞を1ml pipetteでゆっくりsuspendしてESMに加える
18. Neo feederの6cm dish 5枚にまいて終わり

約40分かかる

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