ES用mediumの作製

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ESMの作製

• 前日までの準備：DMEM(1), FCS(3)を4℃でthaw
• 他に使うもの：PBS(ES用:4), 2ME(6), 100x nucleoside(NS:8), NEAA(5), LIF(7)
• 50ml syringe, filter(FCSの本数分)

1. 分注済みの100x NS(8)を融かす(ESM 1bottle当たり5mlを使用)。融解したらよくsuspendし、透明になるまで37℃に入れておく。
2. ES用のPBSを(4)14ml tube 2本に5ml(a)と9ml(b)分注する
3. Pipetmanを35μlにセット
4. (手袋をする:省略している)
5. 5ml分注したPBS(a)に35μl 2ME(6)を入れる
6. (手袋はすぐに捨てて、ピペットマンは中にEtOHを入れて消毒)
7. 5ml pipetで2MEをよくsuspendし、5mlのうち1mlを9mlのPBSのチューブ(b)に入れる（7x10⁴希釈)。pipetはそのまま
8. 100x Nucleosideのチューブ(8)とNEAAの瓶(5)の蓋を開けてNEAAの瓶に5cc pipetを立てておく
9. FCS(3)をESM 1本につき2本ずつ準備
10. DMEM(1)100ccを余りDMEM保存用bottle(2)に移す
11. 50ml syringeにfilterを付けてシリンダーをbottleの口に立てる(c)。ピストンは抜いて倒れないように立てておく(d)。
    
    ここまでの状態
12. NEAA 5mlをsyringeに入れ、同じpipetteでnucleosideをよくsuspendした後に5ml入れる
13. 希釈した2MEを5ml入れる
14. ピストンをシリンダーにとりつけてairが入らないように途中まで入れる
15. FCSをdecantationでsyringeに入れてピストンで押して最後まで入れる
16. 新しいfilterを同じsyringeに付けて2本目のFCSを同様に入れる
17. 1ml pipetでmediumを少量LIFのエッペン(7)に入れて、まとめて吸って入れる
18. 火焔滅菌して蓋を閉めてnaming (e: ESM +20% FCS +NS +NEAA +βME +LIF)
19. Inversion 10回ほどでmix。
    分注前の状態
20. 40mlずつ分注(f: 13本+αになる)し、日付を書いておく。ラブフィルムでシールして4℃へ。期限1週間。

PFMの作製

• ESMと同じ要領でFCS 1本をDMEM 500mlにそのままfiltrationしながら加えて終了。45mlずつ分注する。

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