Feeder

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凍結初代培養細胞の融解

10cm dish 5枚に起こして、3〜4日後にMMC処理。あるいは1 tubeの2/5を1枚の10cm dish, 残りを3枚の10cm dishに起こし、2日後と3日後にMMC処理。 ほぼconfluentになる。
Confluent primary fibroblasts

  1. 10cm dish x 5 ゼラチンコート（30min以上前までに作って37℃へ）
  2. 9ml PFMを14ml tubeに入れて、1ml pipetを入れておく
  3. 37℃恒温槽で塊が小さくなる（3mm前後）まで温める
  4. アルコールタオルで消毒
  5. 火焔滅菌してtransferする、共洗い一回
  6. Cfg. 700rpm 5min
  7. PFM 27ml, 18mlが入った50ml tube 2本を作る(5枚に播く場合。4枚の場合は8ml(14ml tube)と27ml)
  8. supを除いた後PFM 5mlにsuspendし、用意した27mlと18mlにそれぞれ3ml, 2ml入れる(4枚に播く場合8ml PFMに2ml, 27ml PFMに3ml
  9. suspendしてゼラチンを吸引後 10ml/plateでまいてincubatorへ。

MMC処理

  1. 1枚あたりPFM 6ml + MMC 150μlを作成。 Mediumを吸引しMMC入りのmediumで置換する。 →2.5hr後(2hr-3hrを厳守)にMMCを除去する。
  2. wash with 6ml of PBS, 3 times
  3. add 1ml of 0.05% TE, 37℃ 2min
  4. (50ml tube 用意、countの準備)
  5. よく叩く(2min)
  6. add 5ml of PFM、single cell suspension 3-4回
  7. transfer to 50ml tube and measure aliquot
  8. count
  9. (余る場合はここで細胞をspin down, セルバンカーで5 x 106/ml程度に希釈し1ml/tubeで凍結する)
  10. 6cm dish → (1.9-) 2 x 105 /ml (MMC処理後凍結した細胞を使用する場合は2.4 x 105 /ml )x 3ml each
  11. 12, 24, 48 well → 1.5 x 105/ml (MMC処理後凍結した細胞を使用する場合は1.8 x 105 /ml )x 800μl, 400μl, 200μl each
  12. このような濃度の細胞浮遊液を作りゼラチンコートをしておいた各dishにまいてゆく。feederは12(?24?)時間後より使用可能。

Feeder ready to use

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