Preparation of linearized targeting vector

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　直線化して(制限酵素は適切なものを使う)、フェノール抽出・クロロホ ルム抽出・エタノール沈殿で精製してES用PBSに溶解する(500ng/μl x 50μl)。 途中のgelでのチェックは(complete cutのチェックの他に)一番最後にもしたほうが良い。

本来はいくつか条件検討が必要だが、今のところこのままで(一応コロニー 数としては)うまくいっている。

大体20μg〜50μg(100μgとしている研究室もある) / 1 x 10⁷cellsで良い。

1. Enzyme cut

     例)
   
     Targeting vector        70μl(0.8μg/μl x 70μl = 56μg...50μg強なら良い)
     10x M buffer            20μl
     SfiI                    10μl
     DW                     100μl
     -----------------------------
     Total                  200μl
   
     Incubate overnight
     

2. Check complete cut on mini-gel(1〜2μlを流す)
3. add Phenol 200μl, vortex, 15000rpm 5min
4. transfer to a new Eppendorf.
5. add CIAA 200μl, vortex, 15000rpm 1min
6. transfer to an autoclaved Eppendorf.
7. add 10μl 5M NaCl, vortex (NaOAc 20μlでも良い) この時DNA量をもう一度推定します。
8. add 500μl 100% EtOH, vortex(-20℃で安定に保存できる)
9. 15000rpm 10min, discard sup
10. rinse with 500μl 70% EtOH（この後はclean benchの中で行います）
11. air dry(結構気を使ってきちんと乾かしています)
12. dissolve in 100μl PBS(ES用：予め分注して持ってきておいています) （ピペッティングできちんと溶かしています）
13. use 50μl for electroporation

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