検出方法

暫定法
平成６年１０月に厚生省から通知がありました。
＜概要＞原水または浄水をメンブレンフィルターでろ過する。アセトンでフィルターを溶解し、遠心沈澱を繰り返しアセトンを除く。蔗糖浮遊法でオーシストを精製する。精製サンプルを２５ｍｍのメンブレンフィルターでろ過し、間接蛍光抗体法で染色する。フィルターをスライドグラスに乗せ、ＤＡＢＣＯでフィルターを透明化し、カバーグラスをかけてマニュキュアで封入する。微分干渉装置付き落斜蛍光顕微鏡を用いてＢ励起でアップルグリーンの蛍光を発するオーシストを観察する。微分干渉装置を用いて内部構造を観察しCryptosporidiumである事を確認する。

＜問題点＞

遠心分離作業が多くオーシストのロスが大きい。
蔗糖浮遊法では精製しきれず藻類等の夾雑物が多く残る。
夾雑物が多いため最後にろ過するのフィルターの枚数が多く必要となり、結果的に観察するスライドが多くなる。
夾雑物に埋まったオーシストは染色されず、false negative となる。
最後のろ過でオーシストの内容が抜ける事が多い。
微分干渉による内部構造確認には熟練を要する。
生死判定、種の特定ができない。もっともアセトンを使用するので生死判定は出来たとしても結果がおかしくなる。
DAPI染色で染まりにくいので、偽陽性の可能性が高くなる。

＜改善方法＞

アセトンの代わりに超音波発生装置でフィルターから剥ぎ取る方法がある。完全に取れなくても後の遠心沈澱の回数が減るので結果的に回収率はあがると思われる。生死判定にも使用出来る。
蔗糖溶液にＥＤＴＡ、界面活性剤を加え、ｐＨを９．０にすると、濁質が分散して精製しやすくなるという報告がある。後でｐＨを中性に戻す必要あり。
最後にろ過する量を減らす。スライドの数は増えるが、オーシストがよく染まり夾雑物が少ないので、観察が容易になり結果的に回収率があがる。
その他様々な改良法が試みられている。

イムノ・マグネチック・ソーティング（ＩＭＳ）
直接法と間接法がある。マグネチックビーズは数μｍの物と数十ｎｍのものがある。

＜概要＞
１０ｍｌに濃縮したサンプルに磁性体ビーズで標識した抗体を加えインキュベートする。強力な磁石を埋め込んだチューブラックを用いて、ビーズとともに吸着しているオーシストを分離する。この操作を１０ｍｌの試験管と１．５ｍｌのエッペンドルフチューブとで行い最終的に５０μｌにする。これをウェルスライド上で乾燥させ、直接蛍光抗体で染色し、観察する。分離にはスチールコットンのカラムを通す方法もある。

＜特徴＞

操作が比較的容易である。
DAPI染色で染まりやすい。

＜問題点＞

１０ｍｌに濃縮する方法が必要である。
いくつか報告があるが、コロイダルクレー、金属、有機物及び凝集剤を含む水は回収率が落ちるといわれている。
水の性質により回収率が変わる。ただ、同じ水なら初心者でもほぼ同じような回収率が得られる。

フローサイトメトリー・セルソーティング（ＦＡＣＳ）
蛍光と光分散を測定し、その結果に応じて粒子を分離する。

＜概要＞
メンブレンフィルターまたは凝集法により試料を濃縮する。蛍光色素で標識した抗体で染色する。フローサイトメトリーで測定分離を行う。分離した試料をフィルターにとり落斜蛍光顕微鏡で観察し確認する。

＜特徴＞

測定・ソート時間が非常に短い。５～１５分程度。
きれいに分離されるので、観察時間も短縮できる。１５分程度。

＜問題点＞

装置が高価である。約４０００万円。
ソーティングには熟練が必要。
大きな粒子（＞１００μｍ）があるとセルやチューブが目詰まりする。
優れた抗体が必要。

バイタル染色
核を染める蛍光色素で染色し、その取り込みにより生死を判定する。

＜概要＞
オーシストを含むサンプルを乾燥させたスライド上で染色する。

＜特徴＞

操作が簡単。
ＩＦＡと同時に出来る。

ＤＡＰＩ／ＰＩ染色の場合。
ＤＡＰＩに染まり（＋）ＰＩは染まらない（－）のは生存。
ＤＡＰＩ（＋）、ＰＩ（＋）は死亡。
ＤＡＰＩ（－）、ＰＩ（－）は生存しているがオーシストウォールが色素を取り込まない状態で、さらに酸等で処理をする事によりＤＡＰＩ（＋）、ＰＩ（－）になる。
ただし、これはうまくいかないという報告もあり、Method1622のDEC(1998)版ではDAPIだけが採用されている。
ＤＡＰＩだけでもＩＦＡと同時にやっておくと、オーシストの中に４つの核が染まり、オーシストである事の確認がしやすいので便利。（Photoを参照してください。）

DAPI染色について
煮沸したり、有機溶剤で処理するとDAPIで染まり易くなるといわれています。試しにやってみましたので、見てください。

メタノール処理の写真

ＰＣＲ
１ｍｌ程度に濃縮した試料から、CryptosporidiumのＤＮＡを抽出し特異的なプローブを増幅させ、ＤＮＡを検出する。
DNAではなく、ｒRNAを使ったRT-PCRをやった方が感度が高くうまくいくともいわれています。

＜特徴＞

感度が高い。
種が特定できる。

＜問題点＞

１ｍｌまで濃縮する方法が必要。
操作が煩雑（だと思う）。
フミン質等が妨害になるので、あらかじめマグネチックキャプチャー等で取り除いておく必要がある。

蛍光 ｉｎｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
ｒＲＮＡに相補のプローブを蛍光色素でラベルし、ハイブリダイズさせる。

＜特徴＞

生死判定、種の特定が出来る。
操作は比較的簡単。
開発途上

＜問題点＞

蛍光が弱い。
よいプローブの獲得が重要。

Flow Cytometry を中心とする検査方法に関する総説の訳(G.Vesey著）

METHOD 1622
米国環境省(USEPA)は新しい標準法として、METHOD 1622のドラフトを発表しました。内容は３種類の収集法、IMSによる精製、蛍光抗体法及びDAPIによる染色です。検査方法が非常にシンプルになり、回収率も高くまた安定したとのことです。
METHOD 1622では、試料のろ過法としてGelmanのカートリッジ・フィルター、ImmuCelのVortex FilterおよびCorningのディスク・フィルターが採用され、濃縮試料の精製・純化法として免疫磁気ビーズ分離法(IMS)、検出法としてウェルスライド上でFITC直接抗体及びDAPIによる染色が採用されています。
日本でそのまま使えるかどうかは判りません。
USEPAのMicrobiology Home Page METHOD1622のドラフトの原文があります。ファイルを読むのに別にAdobe Acrobat Readerが必要です。
Gelmanのフィルターについて詳しくは Microbiological Analysis: Envirochek Sampling Capsule を見てください。
ImmuCellのVortex Flow Filterについては Biotechnology Products が詳しいです。

The Water Supply (Water Quality)(Amendment) Regulaions 1999 SI No 1524: Cryptosporidium in Water Supplies
英国でCryptoに関する基準ができました。そのための検査法も発表されました。やはり磁気ビーズを使った方法ですが、ろ過濃縮法が独特です。
Drinking Water Inspectrateのサイトから入手可能です。

Cryptosporidium検査実践コーナー

検査法トラブルシューティング

IMSのコツ集

ビニールフレームスライド法

Vinyl Frame Slide Preparation

従来のFITC抗体とBTF Easy Stainの比較 Comparion of conventional FITC antibody and BTF Easy Stain

BTF Easy Staindeで非特異的に染色される生物 Nonspecifically stained organisms with Easy Stain

BTF Easy Staindeで非特異的に染色される生物2 Nonspecifically stained organisms with Easy Stain 2

BTF Easy Staindeで非特異的に染色されるジアルジアによく似た生物 Nonspecifically stained Giardia-like organisms with Easy Stain

高張液中のオーシストとPBS中のオーシストの形態の比較。

ホストフリー培養（Hijjiwaの方法、Boxellらの方法)

書籍：クリプトスポリジウム　－解説と試験方法－