| 研究概要 |
| 私達は、高等植物の培養細胞系を用いて、二次代謝産物、特にチロシンからＤＯＰＡを経てベタシアニンに至る生合成系の初期段階における制御機構を調べている。高等植物の花弁や葉に含まれる主な赤色色素はアントシアニンとベタシアニンに大別されるが、フェニアルアラニンを前駆体として生成されるアントシアニンは植物生理生化学的にも分子生物学的にも詳細な検討が加えられている。一方、同じ芳香族アミノ酸のチロシンから生成されるベタシアニンは、植物界における分布が極めて限定されており、生合成に関与する酵素群をはじめ代謝経路自体が殆ど解明されていない。また、この両色素は、組織レベルでの分布、活発に生合成される細胞の成長ステージ、植物界における分布などの点で非常に対照的な性質を示し、植物生化学の分野において大きな謎となっている。 そこで私達は、ベタシアニンを作る植物の一つであるマツバボタンを材料として、その無菌発芽種子の芽生えから誘導した赤色カルスおよび懸濁培養細胞系を確立し、実験に供している。そして、ベタシアニンや中間代謝産物であるＤＯＰＡ（ジヒドロキシフェニルアラニン）の生合成において、キーステップと考えられているチロシンの水酸化反応に着目して研究を行っている。この水酸化反応を触媒しているチロシンヒドロキシラーゼは、ホ乳類のカテコールアミン代謝のキーエンザイムであり、パーキンソン病の病態研究を中心に詳細な研究が行われてきた。しかしながら、高等植物からは未だ単離・精製されていないので、この酵素の発見と代謝系における制御機構の解明を目指している。 植物は多種多様のポリフェノール化合物を生合成しているが、近年、その抗酸化活性や抗ガン作用などが次々と見いだされ、機能性食品成分として大きな脚光を浴びている。しかしながら、植物になぜポリフェノール化合物が合成・蓄積されるのか、未だ解明されていない。さらに、このポリフェノール化合物を酸化するポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）は多くの植物に含まれいるが、果実や野菜の褐変化を引き起こすため、農学・園芸学の分野で詳細な研究が行われてきたが、生理的機能については未解明のままである。そこで私達は、通常は酵素活性がマスクされている不活性型ＰＰＯ（latent PPO)をいろんな処理で活性化させてその機構を解明し、in vivoでの再現系を確立して不活性型ＰＰＯの細胞内での生理的役割を解明したいと考えている。 |
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| 所属学会：日本植物学会、日本農芸化学会 研究会：植物色素研究会 |
| 研究テーマ |
 マツバボタン培養細胞系におけるベタシアニン生合成の制御機構 |
| ６０００Ｌｕｘの連続光照射によって自然発生的にベタシアニンを生合成するようになった赤カルスと、そのカルスから誘導した赤色の懸濁培養細胞系、およびベタシアニンを全く作らない淡黄色のカルスを材料としている。 多くの二次代謝産物は細胞成長の定常期に活発に生合成されるが、このベタシアニンは細胞分裂が最も盛んな対数増殖期に生産されることがヨウシュヤマゴボウ懸濁培養細胞系で明らかにされいる（作田ら）。そこで、マツバボタン培養細胞でもその変動を調べたところ、対数増殖期の後期にベタシアニン量がピークを迎えており、この時ベタシアニン生合成の代謝系においてはin vivoでチロシンからＤＯＰＡへの流れが特に活発になっていることが分かった。しかしながら、このステップを触媒しているチロシンヒドロキシラーゼは高等植物からは発見されていなかったので、同酵素の単離・精製を試み、２３０倍に精製して諸性質等を調べることに成功した（山本ら、２００１）。 その結果、ベタシアニン蓄積量が最大となる時期に呼応して、同酵素の活性が高くなることが分かった。また、ベタシアニンを作らない淡黄色カルスではこのチロシンヒドロキシラーゼ活性は検出できなかった。また、赤色カルスを暗所において退色させ、その後光を再照射するとベタシアニン量の変動は光量に強く依存した。この時、チロシンヒドロキシラーゼ活性も同じような活性のパターンを示したことから、ベタシアニン生合成とチロシンヒドロキシラーゼ活性の強い相関関係が示唆された。現在、さらに詳細な研究を進めている。 |
 マツバボタンにおけるｌａｔｅｎｔなポリフェノールオキシダーゼの活性化機構 |
| 高等植物に広く分布するポリフェノール類は、強い活性酸素の除去作用を持つので生活習慣病の予防成分として最近注目されている。しかしながら、その生理学的な機能についてはよく分かっていない。さらに、ポリフェノール類を酸化してキノン類を生成するＰＰＯ（ポリフェノールオキシダーゼ）についてもこの５０年近く、多くの植物から精製され、遺伝子レベルでの研究も活発に行われてきた。しかしながら、反応機作は明確になったものの、生理学的機能についてはやはり不明のままである。このようなＰＰＯにあって、通常は酵素活性の発現が押さえられている、いわゆるlatent型の
PPOが存在することが２０数年前に明らかになった。しかしながら、活性型のPPO同様、latent
なPPOの生理学的機能についても全く分かっていない。 本研究室においては、冷凍５年後のハッショウマメ起源のPPOが非常に高い酵素活性を有していることが偶然分かった。そこで、マツバボタン培養細胞起源のlatent なPPOについて、定法に則って数ヶ月間の冷凍処理、SDS,、脂肪酸、トリプシン処理などを行った結果、トリプシンによってＰＰＯ活性が数倍なることが判明した。ところで、latent な酵素は活性抑制という特殊な状態におかれているため、その活性発現機構や活性化物質などが分かれば、生理学的機能を明らかにする上で良いモデル系と考えられる。 そこで本研究では−−− （１）活性化物質としてトリプシンを用いて、懸濁培養細胞からトリプシンによって活性化されるlatent なPPOの単離、精製を行い、約１７０倍精製した酵素標品について酵素化学的諸性質を調べた。その結果、latent PPOも通常の活性型PPOも、分子量は約５２，０００、最適PHは６から７、主な基質はDOPAなどのジフェノール、金属塩や各種化合物の影響もほぼ同じような性質を示した。しかしながら、latent PPOのみで、分光学的および蛍光分光学的レベルでチロシンヒドロキシラーゼ活性が検出された。したがって、latent PPOの生理的機能の一つとして、チロシンヒドロキシラーゼが絡んだ生体内反応に関与している可能性が浮上しており、現在検討中である。 （２）活性化機構については、SDS−PAGE後のタンパク染色や低濃度SDSでの泳動後の活性染色の結果、トリプシン処理の有無によるバンドパターンに影響は殆ど見られなかった。したがって、諸性質の結果もあわせて考えると、latent PPOは酵素タンパクの微妙な構造変化の結果、活性化される可能性が考えられる。今後は、アミノ酸配列の決定、トリプシンによって消化されたアミノ酸の同定を行い、活性化機構の詳細を明らかにしていく予定である。 （３）実際に培養細胞内でトリプシンの代わりに働いている活性化物質の探索を行っている。プロテアーゼ阻害剤の実験結果から、セリン（あるいは金属）プロテアーゼの関与が示唆されているので、電気泳動以後に特殊な染色を行い、メイン一本のプロテアーゼバンドを検出した。次にこのバンドからタンパクを抽出し、ＰＰＯの活性化をみたところ、約２倍に活性化された。現在、このプロテアーゼの同定を試みている。 |
 ハッショウマメにおける不活性型ＰＰＯの生理的機能 |
| 発表論文・著書等 |
| 【発表論文（査読付）】 Yamamoto K., Yoshitama K. and Teramoto S. Purification and characterization of polyphenol oxidase from callus cultures of Portulaca grandiflora. Plant Biotechnology 19(2): 95-101 (2002) Yamamoto K., Kobayashi N., Yoshitama K., Teramoto S. and A. Komamine Isolation and purification of tyrosine hydroxylase from callus cultures of Portulaca grandiflora. Plant Cell Physiology 42(9): 969-975 (2001) Nakamura Y., Teramoto S. and Yoshitama K. Purification and characterization of an S-adenosyl-L-methionine:flavonoid 3'-O-methlytransferase from leaves of Trillium apetalon Makino. Z. Naturforsh. 54c, pp501-507,(1999) Mato M., Ozeki Y., Itoh Y., Higeta D., Yoshitama K., Teramoto S., Aida R., Ishikura N. and Shibata M. Isolation and characterization of a cDNA clone of UDP-galactose:flavonoid 3-O-galactosyltransferase (UF3GaT) expressed in Vigna mungo seedlings. Plant Cell Physiol. 39(1),1145-1155,(1998) Ogata J., Teramoto S. and Yoshitama K. Isolation and characterization of UDP-glucose:cyanidin 3-O-glucosyltransferase from the flower buds of Senecio ×hybridus. J. Plant Res. 111, 213-216, (1998) Ishikura N., Yang Z. and Teramoto S. UDP-D-glucose:flanonol 3-O- and 7-O-glucosyltransferases from young leaves of Paederia scandens. Z. Naturforsch. 48c, 563-569, (1993) Ishikura N., Watanabe Y. and Teramoto S. The formation of flavonoids in cell suspension cultures of Prunus ×yedensis. Bot. Mag. Tokyo 102, 547-560, (1989) Ishikura N., Teramoto S., Takeshima Y. and Mitsui S. Effects of glyphosate on the shikimate pathway and regulation of phenylalanine ammonia-lyase in Cryptomeria and Perilla cell susupension cultures. Plant Cell Physiology 27(4): 677-684, (1986) Teramoto S. and Ishikura N. The formation of catechin procyanidins in cell susupension cultures of Cryptomeria japonica. Bot. Mag. Tokyo 98, 171-179, (1985) Ishikura N. and Teramoto S. Procyanidins and catechin from callus and cell susupension cultures of Cryptomeria japonica. Agric. Biolo. Chem. 47(2):421-423, (1983) 【その他】 ★アメリカデイゴの花におけるUDP-glucose:anthocyanidin 3-O-blucosyltraneferaseの単離と 諸性質 有田哲矢、寺本進、吉玉國二郎 Cryogenics Report of Kumamoto University. 17:15-26 (2006) 吉玉国二郎、緒方潤、寺本進 「花色素合成系酵素の解析」 農林水産技術会議新産業創出フロンテイア研究-研究成果集42-46（2001） Yamamoto K., Kobayashi N., Yoshitama K., Teramoto S. and Komamine A. Purification of tyrosine hydroxylase from callus cultures of Portulaca grandiflora. Cryogenics Report of Kumamoto University. 12: 2-14 (2001) Koike K., Ogata J., Yamaguchi S., Kawanobu S., Teramoto S and Yoshitama K. Isolation and characterization of UDP-glucose: anthocyanin 5-O-glucosyltransferase from fruit skin of egg plant (Solanum melongena L.). Cryogenics Report of Kumamoto University. 12: 15-23 (2001) (Japanese) Mato M., Yoshitama K., Teramoto S. and Ishikura N. Further purification and some properties of flavonoid 3-O-glucosyltransferases from seedlings of Vigna mungo, and changes in those enzymes activities in the first simple leaves and the stems during growth of the seedlings. Rep. of Memories of The Faculty of General Education 32, 9-20, (1997) Nakamura Y., Teramoto S. and Yoshitama K. Purification and characterization of an S-adenosyl-L-methionine:flavonol 3'-O-methlytransferase from leaves of Trillium apetalon Makino. Cryogenics Report of Kumamoto University. 7:12−21 (1996) Mato M., Yoshitama K., Teramoto S. and Ishikura N. 明所および暗所で生育させたケツルアズキのフラボノイドグリコシド含量およびフラボノール３-O-グリコシルトランスフェラーゼの変化 Cryogenics Report of Kumamoto University. ６:13−23 (1995) 【著書（分担執筆）】 「植物色素研究法」 95-104 （大阪公立大学共同出版会、2004） 「生物化学実験法41：植物細胞工学入門」 61-62, 234-243 (学会出版センター, 1998） 「植物組織培養の生物学」 152-159 （朝倉書店、1993） 「L-DOPA production in plant cell cultures」Biotechnology and Agriculture and Forestry (Springer-Verlag), Vol.4, 209-224 (1989) |
| 学会・研究会発表 |
| 【学会発表】 手島文香、寺本進、吉玉國二郎 マツバボタン培養細胞で生成されるベタレイン系色素及びフェノール性化合物の抗酸化活性 日本植物学会第６８回大会（神奈川、２００４） 手島文香、寺本進、吉玉國二郎 マツバボタン培養細胞における抗酸化活性 日本植物学九州支部合同大会（福岡、２００４） 道下達也、吉玉國二郎、寺本進 マツバボタン培養細胞系におけるlatentなポリフェノールオキシダーゼについて 日本植物学会九州支部合同大会（福岡、２００２） 宮崎真也、寺本進、吉玉國二郎 アメリカデイゴの花におけるフラボノイド３−Ｏ−グルコシド配糖体化酵素の精製と特性 日本植物学会第６６回大会（京都、２００２） )道下達也、吉玉國二郎、寺本進 マツバボタン培養細胞系におけるlatentなポリフェノールオキシダーゼについて 日本植物学会第６６回大会（京都、２００２） 山本健一、吉玉國二郎、寺本進 マツバボタン培養細胞系におけるポリフェノールオキシダーゼについて 日本植物学会第６５回大会（東京、２００１） 小池晃、緒方潤、川信修治、山口雅篤、寺本進、吉玉國二郎 なすの果皮に含まれるUDP-glucose:anthocyanin 5-O-glucosyltransferase（５ＧＴ）の諸性質について 日本植物学会第６４回大会（静岡、２０００） 山本健一、寺本進 マツバボタン培養細胞系におけるベタシアニン生合成とチロシン水酸化について 日本植物学会第６２回大会（秋田、１９９９） 緒方潤、寺本進、吉玉國二郎 シネラリアの蕾におけるＵＤＰＧ：シアニジン３-O-グルコシルトランスフェラーゼの精製と諸性質 日本植物生理学会（北海道、１９９８） 間藤正美、小関良宏、伊藤佳央、樋下田大介、吉玉國二郎、寺本進、間竜太郎、柴田道夫 ケツルアズキ実生からのＵＤＰＧガラクトースフラボノイド３-O-ガラクトシルトラン トランスフェラーゼをコードしているｃＤＮＡの単離およびその性質 日本植物生理学会（北海道、１９９８） 緒方潤、山口絵理、坂本卓也、寺本進、吉玉國二郎 シネラリアの花弁におけるMalonyl-CoA:cyanidin 3-O-glucoside malonyltransferase の精製とその諸性質 日本植物学会第６１回大会（広島、１９９８） 緒方潤、寺本進、吉玉國二郎 シネラリアで検出されたシアニジン３-O-グルコシルトランスフェラーゼの諸性質 日本植物学会九州支部合同大会（別府、１９９７） 山本健一、寺本進 シロツメクサの老化過程におけるタンパク質分解酵素活性の変化について 日本植物学会九州支部合同大会（別府、１９９７） 藤山美幸、寺本進 マツバボタンカルスにおけるベタシアニン生成の制御機構 日本植物学会九州支部合同大会（鹿児島、１９９６） 中村友紀、寺本進、吉玉國二郎 エンレイソウの葉のフラボノール３’−O−メチルトランスフェラーゼについて 日本植物学会第５９回大会（金沢、１９９５） 小林直子、寺本進 マツバボタンカルスにおけるチロシンヒドロキシラーゼの精製とその諸性質 日本植物生理学会1995年度年会（松江、１９９５） 小林直子、寺本進、石倉成行 マツバボタンカルスにおけるベタシニアニン生成制御機構について 日本植物学会第５８会大会（札幌、１９９４） 間藤正美、寺本進、吉玉國二郎 ケツルアズキ芽生えの葉および茎におけるフボノール３-O-グリコシルトランスフェラーゼ活性 について 日本植物学会第５８会大会（札幌、１９９４） 間藤正美、寺本進、吉玉國二郎 ケツルアズキ芽生えの第一単葉および茎におけるフラボノイド配糖体とフボノール３-O-グリコシルトランスフェラーゼについて 日本植物学会九州支部合同大会（福岡、１９９４） 松尾和子、寺本進、石倉成行 マツバボタン培養細胞におけるベタシアニンの生成制御機構について 日本植物学会九州支部合同大会（福岡、１９９２） 寺本進、石倉成行、駒嶺穆 ハッショウマメカルスにおけるＤＯＰＡ蓄積の抑制機構 日本植物学会第５７回大会（奈良、１９９２） 楊志慶、石倉成行、寺本進 コマユミからの３種類のフラボノールO-グルコシルトタンスフェラーゼの性質 日本植物学会第５７回大会（奈良、１９９２） 早乙女明子、寺本進、駒嶺穆 ハッショウマメ培養細胞におけるＤＯＰＡ生成の制御 第１０回植物組織培養シンポジウム（仙台、１９８７） 寺本進、早乙女明子、駒嶺穆 ハッショウマメにおけるポリフェノールオキシダーゼについて 日本植物学会第５２回大会（筑波、１９８７） 寺本進、駒嶺穆 ハッショウマ培養細胞におけるＤＯＰＡ蓄積の抑制機構 第９回植物組織培養シンポジウム（神戸、１９８５） 寺本進、駒嶺穆 ハッショウマメカルスにおけるＤＯＰＡ蓄積の抑制機構−シキミ酸経路の代謝調節 日本植物学会第５０回大会（新潟、１９８５） 寺本進、石倉成行 スギ培養細胞におけるカテキンおよびプロアントシアニジンの生成 日本植物生理学会１９９４年度年会（金沢、１９８４） 石倉成行、寺本進 スギ培養細胞のフラバン生成とその制御 日本植物学会第４９回大会（札幌、１９８４） 寺本進、石倉成行 スギ培養細胞におけるプロアントシアニジンの生成II 日本植物学会九州支部合同大会（福岡、１９８３） 寺本進、石倉成行 スギ培養細胞におけるプロアントシアニジンの生成II 日本植物学会第４８回大会（京都、１９８３） 石倉成行、寺本進 スギ培養細胞におけるプロアントシアニジンの生成 日本植物学会第４７回大会（東京、１９８２） 【国際学会】 Ishikura N., Yang Z. and Teramoto S. UDP-D-glucose:flanonol 3-O- and 7-O-glucosyltransferases from young leaves of Paederia scandens. Proc. of XV International Congress, 1993, Yokohama, Japan shikura N., Teramoto S. and Mato M. The formation of flavonol glycosides and properties of flavonol O-glycosyltransferases in seedlings of Vigna mungo. Proc. of XV International Congress, 1993, Yokohama, Japan 【研究会、その他】 寺本進 ハッショウマメ培養細胞におけるDOPA蓄積の抑制作用 植物色素研究会第２回集会（鹿児島、1990） 山本健一、寺本進 高等植物の培養細胞系におけるベタシアニンの生成制御 植物色素研究会第１０回集会（宮崎、1998） |
| 卒業・修了学生研究テーマ一覧 |
| 【卒論指導学生及び卒論テーマ】 一ノ瀬靖則：ナンキンマメ培養細胞への紫外線照射におけるP-クマル酸配糖体生成の誘導機構 タン・センキー：ハッショウマメの成葉に含まれるフラボノイド成分の生化学的分析研究) 山下晃弘：ハッショウマメのポリフェノールオキシダーゼについて 松尾和子：マツバボタンカルスにおけるベタシニアニン生成制御機構について 辻尚宏：マツバボタン培養細胞におけるベタシニアニン生成の制御機構 田村幸子：マツバボタンカルスにおけるベタシニアニン生成制御機構について 小林直子：マツバボタン培養細胞におけるベタシニアニン生成制御機構 船津由樹：コマユミ懸濁培養細胞系におけるアルドースレダクターゼの諸性質について 中山淳也：コマユミ懸濁培養細胞系におけるアルドースレダクターゼの諸性質について 中村奈美：シロツメクサの葉の老化過程における生化学的変化について 後藤隆憲：ハッショウマメのチロシン水酸化酵素について 藤山美幸：マツバボタン培養細胞におけるベタシニアニン生合成の制御機構 峯村信広：シロツメクサの葉の老化過程におけるグルタミンシンテターゼの役割について 山方香代：ハッショウマメのカルスにおけるポリフェノールオキシダーゼについて 山田文：マツバボタン培養細胞におけるベタシニアニン生合成の制御機構 山本健一：シロツメクサの葉の老化過程におけるタンパク質分解酵素活性の変化について 金子誠一郎：マツバンボタンのカルスにおけるポリフェノールオキシダーゼについて 松浦有理香：マツバボタンカルスにおけるベタシニアニンの生合成について 黒木史仁：ハッショウマメの葉に含まれるlatentなポリフェノールオキシダーゼについて 堀圭介：マツバボタン培養細胞系におけるDOPAoxidaseのlatentなformについて 長野華子：マツバボタン懸濁培養細胞系における細胞成長とベタシニアニン生成について 吉田里沙：マツバボタンカルスにおけるlatentなポリフェノールオキシダーゼについて 道下達也：マツバボタン懸濁培養細胞系におけるlatentなDOPAオキシダーゼの部分精製とその性質 田中真二：マツバボタンの花弁とカルスに含まれるベタシアニン化合物の単離と同定 江夏武彰：マツバボタン懸濁培養細胞系におけるlatentＰＰＯの活性化酵素の探索 兼平佑一：ハッショウマメの葉にlatentなＰＰＯの水酸化酵素活性について 西村公俊：ハッショウマメの葉の成長段階とＰＰＯ活性の関係について 吉海綾乃：ハッショウマメの葉に含まれるlatentなＰＰＯの精製 【修論指導院生※及び修論テーマ】 １）小林直子：マツバボタンカルスにおけるベタシニアニン生成制御機構について ２）中村友紀エンレイソウの葉のフラボノール３’−O−メチルトランスフェラーゼについて ３）山本健一：マツバボタンカルスにおけるチロシンヒドロキシラーゼについて ４）道下達也：高等植物に含まれるlatentなポリフェノールオキシダーゼの活性化機構 ５）江夏武彰：ハッショウマメの葉におけるl活性型ＰＰＯ活性の阻害機構 ６）兼平佑一：マツバボタン懸濁培養細胞系におけるベタシアニン生合成と光照射の関係について 【博士論文指導院生※及び博士論文テーマ】 １）楊志慶 ２） 間藤正美：フラボノイド配糖体化の多様化と配糖体化反応のメカニズム ３）緒方潤：Isolation and characterization of UDP-glucose:anthocyanin glucosyltransferase in the flowers of Senecio ×hybridus and Dahlia variabilis. ４）山本健一：Control mechanisms of betacyanin biosynthesis in callus cultures of Portulacagrandiflora. ※助手は指導教官になれないが、共同研究者となって指導した。 |
| 担当科目・学内外活動 |
| 専門科目 |
| 生物学基盤実験（１年生）、生物学共通実験（２年生）、細胞生物学実験（３年生）、基礎講読、卒業研究（４年生）,、研究室ゼミ（４年、院生）、細胞生物学概論（４年生） |
| 一般教育科目 |
| 最前線の生命科学Ｇ |
| サークルなどの学内活動 |
| 熊本大学体育会準硬式野球部部長 夢科学探検（〜2009）；「植物の体をのぞいてみよう」、「ぼくらは美白探検隊」、「花の色でｐＨ試験紙を作ろう」（３位入賞）,「ホタル狩りをしよう！（３位入賞）」、「発泡スチロールでスタンプ！」。 |
 学会活動・学外非常勤 |
| 日本植物生理学会第51回年会準備委員会−総務 (2011) オープンキャンパス(〜2010) 日本植物学会九州支部−熊本県委員(2005〜2006、2009〜2010) 日本植物学会弟７０回（熊本）大会準備委員会-庶務 (2006) 日本動物・植物・生態三学会合同大会（熊本）準備委員会-庶務 (2002) 植物色素研究会会計 （1988〜） 西日本リハビリテーション学院非常勤講師（生物学、1990-2000） 八代高専生物工学科非常勤講師 (2005) ウインターサイエンスキャンプ(2004) 生物学オリンピ ック、桜山中学校出前授業(2005) 西日本リハビリテーション学院非常勤講師（1990-2000） 第15回日本植物細胞分子生物学会準備委員会−庶務(1997) |
