私の日記

日記帳08　遺伝子クローニング技術

（H16年6月8日）　それぞれのトランスフェクション

　1)リン酸カルシウム法
　　最も古くからトランスフェクションの方法として用いられてきた。一過性、恒久性のどちらの形質発現にも用いられる。あらかじめ作製しておいたDNAとリン酸カルシウムの共沈殿物を、細胞がエンドサイトーシスで取り込むことでかなりの量が核に到達する
　 2)DEAE-デキストラン法
　　 DEAE-デキストランとDNAが巨大複合体を形成し、細胞のエンドサイトーシスが促進されると考えられているが、詳細は不明である
　 3)リポフェクション法
　　リポソーム（脂質人工膜の一種）内に遺伝子を封入して細胞と培養する方法である
　 4)リセプター媒介法
　　肝臓細胞表面のリセプターと親和性の高い物質とDNAの複合体を用いる方法である
　 5)電気穿孔法・レーザー穿孔法
　　電気パルス、レーザーで原形質膜に穿孔する方法である
　 6)パーティクルガン法
　　タングステンや金の微細粒子にDNAを付着させ、これを火薬の爆発やガス圧で加速し、細胞内に打ち込む方法である
　 7)マイクロインジェクション法
　　非常に細いピペットにDNAを入れてマイクロマニピュレーターで細胞に直接入れる方法。ブリッキング法は、ピペットでなく穴の開いてない鋭利なガラスの先端を用いる方法である
2004年06月08日 11時21分19秒

（H16年6月7日）　トランスフェクションのいろいろ

　 1)遺伝子を動物の組織培養細胞へ直接導入することをトランスフェクションという（生化学辞典）
　 2)トランスフェクションは物理化学的方法と生物学的方法に分けられる
　 3)トランスフェクションされた遺伝子の形質発現のされ方から、一過性であるか恒久性であるかによっても分けられる
　 4)導入される遺伝子の大きさによって、次の三つに分けられる
　　 ①クローニングされた遺伝子でベクターのついた低分子DNA。大きさは約1万塩基対までである。『動物生産生命工学』40ページ
　　　表Ⅱ-3すべての方法で導入が可能である
　　 ②細胞から精製した高分子DNAで、サイズは1万～10万塩基対のものは、リン酸カルシウムやマイクロインジェクション法を使う
　　 ③巨大なDNAでサイズ10万～100万のものは、やはりリン酸カルシウム法を使う
[　5)遺伝子の培養動物細胞へのトランスフェクション（上記した表Ⅱ-3）は、表にして配布する　]
2004年06月07日 10時05分10秒

（H16年6月6日）　形質転換豚の作製

　 1)『応用遺伝学」46ページに、マウスメタルチオネイン遺伝子のプロモーター部分を結合したヒト、ウシの成長ホルモン、ヒトの成長ホルモン放出因子、ヒトのインシュリン様成長因子ーⅠ、マウスアルブミン遺伝子プロモーター部分と結合したヒト成長ホルモン放出因子という人工遺伝子を、ブタの受精卵に顕微注入した実験が説明されている
　 2)尻尾は非翻訳領域である
　 3)形質転換豚の数は少なかったが、臓器で見ると、成長ホルモンの効果が現れていた
　[4)図2-3をコピーして配布する]
2004年06月06日 17時41分41秒

（H16年5月27日）　ヒトゲノムDNAライブラリーの作り方

　 1)DNAを制限酵素で切断する
　 2)何百万種ものDNA断片ができる
　 3)この混合物をプラスミドに挿入する。このとき、1個1個のプラスミドにDNA断片が1個だけ挿入される条件を選ぶ
　 4)これらのプラスミドをを大腸菌に取り込ませる
　 5)大腸菌1個当たり組換えプラスミドを多くても1個しか取り込まないように濃度を調節して、大腸菌細胞に与える
　 6)この大腸菌培養液を培養したものが、ゲノムライブラリーである
　 7)この培養液の一部をすくってシャーレに移し、1個ずつの細菌からコロニーを作らせれば、おのおのがヒトDNAの特定領域を担うクローンである
　 8)アミノ酸配列などから逆に推定したDNAプローブを合成するなどして、そのプローブで特定のDNA領域を選ぶ。これでクローン化できた
2004年05月27日 10時10分14秒

（Ｈ16年5月26日）　遺伝子のクローン化に二種あり

　 1)ある生物のゲノムＤＮＡを制限酵素で切断し、その断片をベクターを使って受容細胞に導入し増殖する
　 2)生体のある細胞の特定のmRNAをDNAに複写したもの（cDNA）を受容細胞に挿入して増殖する
　 3)受容細胞にも二種あって、1)の方は、DNA断片の大きいものがあるので、酵母などを使うこともある。2)の方は原核細胞が使える
　 4)cDNAは、mRNAを発現している細胞からmRNAを取り出し、オリゴdTをプライマアーとして逆転写して作る。しかし多くのcDNAから目的のものを選別しなくてはならない
2004年05月26日 18時04分13秒

（Ｈ16年5月25日）　クローニングに二つある

　 1)分子生物学では、同一の塩基配列を持ったＤＮＡ断片の均一な集団をクローンと呼ぶ。一般にはある遺伝子を分離することを目的として、このような均一の集団を得る
　 2)このような均一なＤＮＡ断片の集団（というが1断片でもよい）を、原核細胞または真核細胞に与えて増加することをクローニングという
　 3)組換えＤＮＡ実験では、不特定多数で多種類のＤＮＡ断片を、プラスミドやバクテリオファージなどのベクターに酵素で共有結合して組換えＤＮＡとし、宿主の細菌細胞中に導入して得られるコロニーあるいはプラークの中から、目的とするＤＮＡ断片を含むクローンを検出して特定のＤＮＡすなわち遺伝子を単離することを、クローン化またはクローニングと呼ぶ
　 4)こちらの意味で使うときは、クローン化と呼ぶことにする
2004年05月25日 16時57分32秒

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