私の日記

日記帳09　ＥＳ細胞の作り方

（H16年6月18日）　多能性の判定条件

　多能性を有するか否かは五つの条件を調べる
　 ①アルカリフォスファターゼ活性をもつ
　 ②支持細胞を除いた条件下で培養したときに、多種類の分化組織からなる胚葉体を形成する
　 ③ヌードマウスの皮下に細胞を注入することによって、多種類の分化組織からなる奇形腫を形成する
　 ④染色体数は正常2倍体（マウスの場合は38本常染色体と1対の性染色体）構成をもつ
　 ⑤キメラ動物を作出でき、ES細胞の性質を次世代にも伝えることができる

　 1)①のアルカリ性フォスファターゼ活性の有無は、未分化細胞と分化細胞を識別するマーカーとしてよく利用される
　 2)②、③は、多分化能を判定するもので、外、内、中の三胚葉に分化していくさまざまの細胞群が観察される
　 3)⑤は、ES細胞を最も特徴付けるものである
2004年06月18日 19時45分38秒

（H16年6月18日）　細胞の核の大きなものが出現する

　 1)支持細胞上で浮遊している胚は、2～3日後には、子宮壁に着床するように支持細胞に接着する
　 2)このとき、周囲に広がりながら増殖する細胞はトロフォブラストで、ICMは細胞塊としての形態を維持しながら増殖する
　 3)この細胞塊中には、分化しつつある細胞と、ごく一部の未分化な細胞がある
　 4)この細胞塊をいったんトリプシンでバラバラにし、新しい培養液と支持細胞上で培養する
　 5)2～3日するといくつかの種類の細胞が増殖する。ほとんどが分化しつつある細胞である
　 6)よく注意して見ると、細胞同士の境界がはっきりせず、個々の細胞の核が異様に大きい細胞群（コロニー）が観察されることがある
　 7)これがES細胞の起源である
　 8)この細胞群を見極めるのが実験者の観察眼である。また、細胞塊をバラバラにする時期も重要である。新しく培養してから2週間して、コロニーが見つかれば、継代できる。なければ分化した細胞である
　 9)4～5代の継代を経て維持したら凍結する
10)この時点ではまだ能力（多能性幹細胞としての能力）は未知である
2004年06月18日 19時23分11秒

（Ｈ16年6月17日）　幹細胞

　 1)幹細胞に二種ある。臓器幹細胞と胚性幹細胞である。幹細胞は自己増殖能と多能性を持った細胞と定義される
　 2)胚性幹細胞は本来は、胚盤胞期胚の内部細胞塊から株化された細胞株のことで、一般にはES細胞と呼ばれる。しかしこの胚性幹細胞が、多能性を持ちつつ自己増殖する性質を持ち続けるのは、内部細胞塊にその性質があることに由来する。したがって、内部細胞塊そのものが幹細胞とも言い得る細胞である。幹細胞の幹細胞である
　 3)臓器幹細胞は、二段階の細胞分化をして、臓器（すべての細胞は臓器の細胞である）の細胞となる。1段目は動機づけの段階で、前駆細胞ができる。それがさらに成熟して臓器細胞となる
　 4)幹細胞の幹細胞である内部細胞塊が分化していくプロセスはしたがって、次のようになる。
　　　　　　胚性幹細胞→臓器幹細胞→臓器前駆細胞→臓器細胞
　　これが発生中の細胞分化である
　 5)[ところで]これまで細胞分化したあとは後戻りできないと考えられてきた。実際、成熟した除核細胞質に外の細胞の核を核移植すると、細胞は移植した核の細胞になる。しかし、同じような操作をして、未受精卵に核移植すると、核が初期胚の状態に戻ることが明らかになってきた。未受精卵の細胞質は成熟した核をリプログラミングする力を持っていることが明らかになった
　 6)現在、幹細胞を、永続的に（無限に）培養しておいて、あるいは凍結保存しておいて、何らかの処置を加えてそれらから臓器を作り出し臓器移植に使うことが、人医の領域や獣医の領域で研究されている
　 7)さらに、臓器幹細胞同士で相互変換しないものかどうか、が研究されている。これは可能であるという成果があると何かで見た記憶がある
　 8）ニューロスフェア法についての説明もあったが、これは理解できなかったので後日改めて書き込むことにする。神経幹細胞の分化誘導の研究についても講義があったが、こちらも省略する
2004年06月17日 11時23分19秒

（H16年6月15日）　胚盤胞を支持細胞上で増殖する

　 1)交配を確認してから4日目の胚を用いる
　 2)透明帯を0.5％プロナーゼで除去する
　 3)採取した胚そのものを培養する。培地はES培地を用いる
　 4)D-MEM液を基本とし、20％ウシ胎児血清、過酸化防止剤としてのβ-メルカプトエタノール、細胞を未分化状態にとどめる分化抑制因子として知られるLIF(leukemia inhibitory factor）を加える
　 5)支持細胞が必要である
　 6)妊娠12～14日の胎児全体を細切し、トリプシンで細胞を分散させた細胞浮遊液を培養皿の底面に接着させておく
　 7)このままでは支持細胞が一方的に増殖するので、あらかじめ、細胞のDNA合成をマイトマイシンという薬品で休止しておく
　 8)雌の子宮から採取した胚盤胞期胚を、この支持細胞上で増殖させる
　 9)ES細胞の培養はpHが酸性に傾きやすいので、毎日、培地を交換して2日ごとに継代する。ES細胞が視野の1/2～1/3を占めた状態がコンフルエントである
2004年06月15日 11時38分39秒

（16年6月13日）　マウス初期胚の変化

　 1)受精後のマウス胚は等分割し、3日後に16割球となる。1個1個の割球は明瞭に区別できる
　 2)その後、外側を占める割球間に強い細胞接着が起こり、割球の区別が明瞭でないモルラ胚となる（コンパクション）。割球間で内側と外側の区別ができる
　 3)4日胚になると、トロフェクトダームと内部細胞塊(ICM)となる
　 4)その後、ハッチングして着床する
　 5)胚の採取は、交配後3.5日齢マウスから行う。子宮に着床する直前で、子宮内に浮遊している。採取した段階では透明帯がついているので、これはプロナーゼで除去する
　 6)[この項は私のメモである。この3.5日胚までは『生殖機能細胞の培養法』184ページを見れば、トロフェクトダームは胚全体を覆っているように見える。また、『実験生殖生理学の展開』46ページには、16細胞期では、外側と内側が区別され、7個が内側でICMになるとあるから、やはりトロフェクトダームは胚全体を覆っていることが分かる。だがやがて着床のころになると、『実験生物学講座』4ページを見れば、ICMは、円筒状の頭部の方にだけ集まっているように見える。その後、遠位内胚葉、近位内胚葉ができて、両者が胞胚腔を囲み、胚体が腔を越えて子宮壁に近づいてしまう過程が理解できない]
2004年06月13日 17時33分15秒

（H16年6月11日）　1981年にES細胞の技術が確立した

　 1)4日胚のICMから、胚性幹細胞が培養できることが、1981年に報告された
　 2)1984年、培養されたES細胞を4日胚に注入して借親の子宮で発生させ、キメラマウスができることが報告された
　 3)ES細胞は生殖細胞にも分化し、ES細胞由来のマウスが得られた（生殖細胞キメラマウスと正常マウスを交配し、一代雑種個体を作る。一代雑種同士を交配すれば、少なくとも一つの遺伝子座については、ES細胞由来遺伝子をホモに持つ個体を作れる）
　 4)つまり、培養されたES細胞は、1匹のマウスと等価であった
　 5)培養系で10の8乗個の細胞を扱うことは困難でない
　 6)相同組換えには10の６乗個の細胞があればよいという計算がなされている
　 7)そしてマウスへの遺伝子操作ができるようになった
　 8)一代雑種個体同士を交配するのは、ES細胞のほとんどが雄由来だからである
2004年06月11日 12時13分42秒

（Ｈ16年6月9日）　幹細胞とは

　 1)血液、皮膚、腸上皮、生殖器などの細胞はいったん分化し成熟するとそれぞれ寿命をもって死滅する
　 2)これを補給するために、未分化の幼若細胞が新たに増殖分化し、成熟して定常状態を保っている
　 3)このような幼若・未分化の親細胞を幹細胞と呼ぶ
　 4)幹細胞は、分化せずに自分自身と同じ幹細胞を複製する能力をもつ
　 5)血液幹細胞は最も研究が進んでいて、すべての血液細胞は1種類の幹細胞から分化してできることが証明されている
　 6)幹は、幹細胞の自己増殖によって太くなり、末端の細胞は分化して枝葉を形成する
　 7)動物の体も自己増殖を続ける未分化幹細胞から枝分かれしたものである
　 8)赤血球や白血球は、骨髄内で維持されている造血細胞から派生してくる
2004年06月09日 14時03分42秒

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