私の日記

日記帳10　鶏胚の移植

（Ｈ16年6月23日）　始原生殖細胞にＸ線を照射する

　 1)ニワトリの始原生殖細胞は、採集しやすく、遺伝子操作もできるので、トランスジェニックニワトリの作出にはうってつけである
　 2)しかし、レシピエント胚に対して何の前処理もせずに移植すると、ドナー胚の始原生殖細胞数がレシピエント胚のそれより格段に少なく、レシピエント胚の生殖系列に入り込まない場合が多い
　 3)そこでレシピエント胚の始原生殖細胞の数を減らすことを目的に、ニワトリ胚盤葉に軟Ｘ線を照射し、照射した個体の発生状況と初期胚の始原生殖細胞数とを調べた
　 4)その結果、すべての胚盤葉において、軟Ｘ線の照射が有効であった
2004年06月23日 13時27分45秒

（Ｈ16年6月21日）　始原生殖細胞を用いる遺伝子導入

　 1)トランスジェニックニワトリを作出し、卵の中に医薬品などの有用物質を作ることが目的である
　 2)トランスジェニックニワトリを作る方法は、二つある
　 3)一つは、未分割の受精卵に直接外来遺伝子を導入する方法である
　 4)二つ目は、外来遺伝子を導入した細胞（胚盤葉細胞、始原生殖細胞、ES細胞など）の移植により生殖系列キメラを作製し、後代にトランスジェニックが出ることを期待する方法である
　 5)1細胞期の受精卵に外来遺伝子を導入して作出するトランスジェニックニワトリは、ロスリン研究所のグループが成功しているという
　 6)始原生殖細胞の移植による生殖系列キメラの作製は、今後の鳥類胚操作の中心的手法になると私は考えている
　 7)哺乳類と違って鳥類の始原生殖細胞は、格段に扱いやすいからである
　 8)ニワトリにおいては、それは胚盤葉上層が起源であるが、孵卵18時間ごろの原条期に生殖三日月環とよばれる部位の胚盤葉下層に移動し、その後、血管系の発達につれて血流中を循環し、孵卵3日目ごろまでに生殖隆起に到達する
　 9)血流中の始原生殖細胞を採取し、リポフェクション法などで遺伝子をトランスフェクションし、レシピエント胚に移植すれば、かなりの頻度で生殖系列キメラができるのである。実際この方法で、Naitoらは遺伝子導入に成功したことを報告している
2004年06月21日 18時23分56秒

（H16年6月21日）　ニワトリ胚の培養

　 1)システムⅠ
　　 ①1細胞期の受精卵（濃厚卵白が付いている）は、培養液（水様性卵白）とともにガラスびんに入れる
　　 ②ラップでガラスびんの口を密閉する
　　 ③41.5℃で24時間培養する。このとき胚盤が卵黄の真上に位置し、培養液に沈まないようにする
　 2)システムⅡ
　　 ①受精胚から濃厚卵白と培養液を除去し卵黄部分だけを取り出す
　　 ②あらかじめ鋭端部分を直径3㎝になるように切り取った卵殻を用意しておく
　　 ③その中に卵黄部分を入れる
　　 ④卵殻に水様性卵白を満たして空気を完全に除去してから卵殻の切り口をラップで密封し、保定リングで固定する
　　 ⑤これを転卵しながら38℃で3日間培養する
　 3)システムⅢ
　　 ①システムⅡでステージ18という発生段階に進む
　　 ②システムⅡの内容物を、鈍端部直径4㎝に切り取った別の大きな卵殻に移す
　　 ③培養4日目なら卵黄はまだしっかりしていて移植に耐える
　　 ④ステージ18に達した胚は、しょう膜に完全に覆われるので、表面が空気に触れても乾燥しなくなっている
　　 ⑤卵殻の切り口をラップで密封し、転卵しながら14日間培養する
　　 ⑥その後は転卵をとめて4日間培養し、21日目になると肺呼吸を始めるので、ラップに穴を開け呼吸を助ける
　　 ⑦しょう膜に分布している血管から血液がなくなると孵化するので、その少し前にラップを取り除き、シャーレをかぶせておく
　　 ⑧培養22日に孵化する
2004年06月21日 11時36分48秒

（H16年6月21日）　輸卵管を切り出し受精卵を取り出す

　 1)雌ニワトリにネンブタール麻酔をかける
　 2)左腹を開腹し、輸卵管を子宮部から受精卵のある位置までたどり、受精卵の入っている輸卵管部分を切り出す
　 3)切り出した輸卵管をガラス皿に移す
　 4)輸卵管を手に乗せ、輸卵管壁と濃厚卵白との間にハサミをいれ、輸卵管を切り開く
　 5)50ccのビーカーを輸卵管と濃厚卵白の間に差し込む
　 6)受精卵をビーカーに回収する
　 7)前もって水様性卵白10ccを注射筒に吸い取っておく
　 8)その半量をプラスチックびんに、残りを受精卵にかける
　 9)受精卵を滑らせるようにしてビーカーからプラスチックびんに移す
2004年06月21日 10時23分22秒

（H16年6月20日）　放卵後2時間45分に採取する

　 1)放卵後に次の卵が卵巣から排卵される。そして直ちに受精する
　 2)1細胞期の受精卵を取り出すためには、放卵時刻が一つの目安になる
　 3)雌ニワトリがその日の朝何時に卵を生んだか全部記録する
　 4)放卵後2時間45分に輸卵管から受精卵を取り出す
　 5)この時間は、ある程度濃厚卵白の付いた受精卵が採集できる時間である
　 6)これより早く採集すると、付加した濃厚卵白が少なく、その後の発生率が悪い
　 7)これより遅いと、すでに卵殻膜が付き始めており、胚も2細胞へと進行している
　 8)膨大部と峡部の境界から5cmほど膨大部側にある受精卵が、精子核と卵子核が融合する直前で、遺伝子の注入に最適である
2004年06月20日 18時09分01秒

（H16年6月20日）　漏斗部で受精し子宮部に20時間過ごす

　 1)ニワトリの輸卵管は、漏斗部、膨大部、峡部、子宮部、膣の各部からなる
　 2)卵巣から排卵された卵は、漏斗部に入り、ここで受精する
　 3)膨大部で濃厚卵白が付加される。ここに3時間ほど留まる
　 4)峡部に入る前後で2細胞へと進行する
　 5)峡部では、水様性卵白・卵殻膜が付加される
　 6)子宮部で卵殻が形成される。その間、卵は鋭端を先頭にしながら回転し、その回転によるねじれでカラザが形成される
　 7)卵割を繰り返して細胞数を増した胚は、1層の細胞層を形成する。子宮部に20時間過ごし、排卵から24～27時間で放卵されるが、そのときには細胞数は約6万になっている
2004年06月20日 17時46分38秒

（H16年6月19日）　ニワトリの腹の中から受精卵を取り出すことができた

　 1)卵に有用物質を生産させることができれば、養鶏産業に大きな革命をもたらす
　 2)私は、動物バイオテクノロジーのこれからの焦点となるのは、カイコとニワトリと見ている。トランスジェニックカイコ、トランスジェニックニワトリ時代だと考えている
　 3)どちらも、わが国には伝統がある
　 4)とくにニワトリについては、産業として大きな地歩を占める。新しい卵は、新しい産業の可能性を秘めている
　 5)本講は、そのような観点に立って、遺伝子導入により卵に有用物質を生産するための基礎的実験を実施してもらっている学生の研究を骨子として、胚移植について、概観するものである
　 6)その基礎はPerry, M. M.（1988）によって与えられた。また、話の大部分は要旨からお分かりいただけるように、『動物生産生命工学』と「内藤充氏」の総説とから得ていることを、まずお断りする
　 7)ニワトリでは受精卵は、雌ニワトリの輸卵管中に存在し、受精後まもなく卵白と卵殻がついてしまうので、哺乳類とは同じようには扱えない
　 8)Perry（1988）が、卵殻のついてない受精卵を雌ニワトリの腹の中から取り出し、それを体外で培養しヒヨコにまで発生させる方法を開発した
　 9)受精卵に遺伝子を導入することが可能になった
2004年06月19日 12時12分05秒

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