私の日記

日記帳12　モノクロナール抗体

（H16年7月6日）　腹水からの回収

　 1）クローニングがすんだら、50ml培養フラスコ中で培養する
　 2）あらかじめ1～3週間前にプリスタン0.5mlを腹腔内注射しておいたBALB/cマウスを用意する
　 3）マウスの腹腔に細胞浮遊液を注入する
　 4）1～2週間後、腹水が貯留しているマウスの下腹部に18Gの注射針を刺し、腹圧でもれてくる腹水を採取する
　 5）3,000回転、10分間遠心し、混在するプリスタンや血球を除き、モノクロナール抗体を得る
2004年07月06日 16時17分07秒

（H16年7月6日）　ハイブリドーマのクローニング

　 1）ハイブリドーマの選択
　　　細胞融合1～2週間後、ハイブリドーマのコロニーの上清を一部とりだし、免疫抗原[赤血球]と反応させる。抗体を産生していることが分かったコロニーは、24ウェルマイクロプレートに移し、HT培地で培養する。さらに二次スクリーニングして、培地を10％FBS-DHEMに切り換え、継体培養する
　 2）クローニング
　　　96ウェルプレートの1列目に0.02mlずつそのほかのウェルに0.01mlずつ10％FBS-DMEM培地を分注する。抗体産生ハイブリドーマを継体培養したのちに、0.02mlを1列目の上端から下端へ順番に希釈した後、続いて左端から右端へ0.1mlずつ希釈をくりかえす。1～2日後、顕微鏡で検鏡し、1ウェルに1つだけコロニーのウェルの上清を三次スクリーニングに用いる。抗体ができていることがわかったら、クローニングを2回以上行い、液体窒素で保管する
2004年07月06日 15時03分41秒

（H16年6月29日）　細胞融合

　 1）ミエロ－マ細胞の調整
　　培養中のミエローマ細胞（P3U1、NS-1等）を遠心管に移し、1.200回転で5分間遠心し、DMEM培地10mlに浮遊させる
　 2）脾細胞の調整
　　最終免疫の3日後に脾臓を無菌的に摘出する。先端を18Gの注射針で切り落とし、くの字に曲げた注射針で脾臓をしごいて、脾細胞をそぎだす。ピペッティングし、試験管内5分静置する。1.200回転で5分間遠心し、DMEM培地10mlに浮遊させる。［赤血球が混ざっていてもよい。脾臓はリンパ球の塊だから、この培地はリンパ球がたくさん浮遊している］［培地と培養液について］
　 3）細胞融合
　　ミエローマ細胞［1）の培地、濃度をあらかじめ数えてtおく］と脾臓細胞［2）の細胞、濃度をあらかじめ数えておく］の割合が1：5～10になるように調整混合し、1.200回転5分間遠心し、上清を除去し、よくタッピングする。DMEM培地で50％に調整したPEG1mlを1分間かけ滴下する。1分間よく振り、DMEM培地10mlを6分間かけて滴下する。3分静置し、800回転で5分間遠心し、上清を除去し、HAT培地10mlを加え、96穴プレートに0.1mlずつ分注する。37℃5％CO2で3日間培養する。細胞分裂を確認し、各ウェルにHAT培地を追加する
2004年06月29日 17時15分48秒

（H16年6月29日）　抗原の免疫

　 1）装置：実体顕微鏡、生物顕微鏡、CO2インキュベーター、液化窒素タンク、オートクレーブ
　 2）実験装置：眼科用ハサミ、眼科用ピンセット、パスツールピペット、真空採血管（ヘパリン入り）、マイクロピペット、遠心菅、18G注射針、血球計算盤、24ウェルマイクロプレート、96ウェルマイクロプレート、培養フラスコ、ピペット、マイクロミキサー、セラムチューブ
　 3）試薬：リン酸緩衝液（PBS）、アルシーバー溶液、DMEM培地、ポリエチレングリコール（PEG）4000番、牛胎児血清（FBS）、DMSO、HAT培地、HT培地
　 4）免疫処置：①10％に調整した赤血球浮遊液0.5mlをBALB/c系マウスの腹腔内に注射する、②1週間間隔で2～4回注射する、③ときに赤血球ゴーストあるいはアジュバントを用いる
　 5）ゴースト：赤血球の形質膜票品。赤血球を低浸透中におくと、ヘモグロビンその他のいわゆる」可溶画分が漏出し、形質膜だけがあとに残る。光学顕微鏡下、抜け殻のように見える。これをゴーストといい、細片化してないものである（生化学辞典495ページ右）
2004年06月29日 12時03分21秒

（H16年6月27日）　モノクロナール抗体の特徴

　 1）モノクロナール抗体は、単一の抗原決定基だけをとらえる抗体である。だから吸着操作を必要としない
　 2）抗原を精製する必要もなく、細胞などをそのまま免疫に用いることができる
　 3）ある抗原に対して特異抗体を有するハイブリドーマを確立すれば、均一な抗体を永久に得ることができる
2004年06月27日 17時36分31秒

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