| 2006年6月26日 (月) |
１ 遺伝子ターゲッティングとは |
1）ある遺伝子に特別な変異を挿入して、その遺伝子をノックアウトしてしまうことを遺伝子ターゲティング（標的遺伝子置換）と呼ぶ
2）細胞の仕事のマニュアルである遺伝子の集団の中で、特定の遺伝子を機能破壊（ノックアウト）することにより、ノックアウトされた遺伝子の機能を知ることができる
3）マウスの遺伝子ターゲッティングの情報は、多くヒトにも有効である
4）ヒトとマウスでは99％以上の遺伝子が共通で、類似の働きをしているからである |
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| 2006年6月27日 (火) |
２ 遺伝子ターゲッティングは相同組換えの結果できる |
1）遺伝子ターゲッティングは、私たちが望む遺伝子をノックアウトする（機能しなくなるようにさせる）手技である
2）相同組換えと呼ばれるプロセスが使われている
3）相同組換えは、同じ塩基配列をもつDNA分子のあいだでおこる現象である
4）体細胞の核に取り込まれたターゲッティング・ベクターは、細胞内の装置であるタンパク質と複合体をけいせいする
5）このタンパク質の助けを借りながら、ベクターはゲノム全体を対になる塩基配列（ターゲット）が見つかるまで探し回る
6）ターゲットを見つけ出すと、その遺伝子と並列する
7）並列した二つの相同なDNAは、同じ場所に切断を受けた後、互いに相手の切断部位に再び結合する
8）塩基配列に変化を受けずに性格に組み換えられる。ここまでが相同組換えの一連のプロセスである |
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| 2006年6月27日 (火) |
３ ES細胞がうまれてジーン・ターゲッティングが可能になった |
1）遺伝子の相同組換えは、ごく一部の細胞でしか起こらないし、またしばしば非相同な位置にでたらめに入ってしまう
2）だから受精らの核中に挿入して相同組換えを期待するのは、かなりむなしい
3）なぜなら目的の位置に組換えが起こる細胞は、1万個に1個の割合だからである
4）過剰排卵させても1万個の受精卵を用意することはほとんど不可能だし、体外培養で1万個の受精卵を用意することもほとんど不可能である
5）体細胞の培養なら1万個の細胞は用意できる。だから体細胞クローンが望まれていた。が、こちらは受胎率が問題である
6）ES細胞が生まれて、この手技はようやく日の目を見ることになった
7）遺伝子をES細胞に組み込むには、プラスミドに組み込んでES細胞に感染させる方法がある（Genetic Engineering、p104、p106）。プラスミドには市販のskベクターなどが使える（3年次学生）
8）エレクトロポーレーションも可能である |
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| 2006年6月27日 (火) |
４ ターゲッティング・ベクターの構造 |
1）塩基配列の一部に人為的に変異を挿入した遺伝子をターゲッティング・ベクターと呼ぶ
2）ターゲッティング・ベクターには二種類のマーカー遺伝子を挿入する
3）正のマーカーと負のマーカーである。正のマーカーは、ベクターが染色体にとりこまれたら（相同部位であっても非相同部位であっても）、細胞の生存や増殖を促進する
4）負のマーカーは、ベクターが非相同部位にとりこまれた場合に、その細胞をふりおとす
5）正のマーカーとしては、通常は、ネオマイシン耐性（neor↑）遺伝子が用いられる
6）これを相同遺伝子のエキソン領域に挿入し、染色体側の標的遺伝子にも存在する相同のDNA配列を両端にもつようにする
7）neor↑を挿入されたターゲッティング・ベクターは、本来の機能が失われる
8）負のマーカーとしては、例えばヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（tk）遺伝子などをターゲッティング・ベクターの一方の端に取り付ける |
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| 2006年6月27日 (火) |
５ ES細胞にターゲッティング・ベクターを入れて、そのあとどうするか |
1）[培養細胞がなければ遺伝子ターゲッティングはなりたたない。しかもその培養細胞は生殖系列にはいらなくてはならない][培養細胞のうちのどの細胞が選抜されることになるのか、というところまでのべる]
2）ターゲッティング・ベクターの構造は、タンパク質コード領域エキソンにneor↑遺伝子、一端にtk遺伝子が組み込んである
3）培養細胞[の核]にベクターを導入する[マイクロインジェクション]
4）ベクターの培養細胞中の運命は次の三つである
�，Δ泙�初期の目的の部位に挿入される（一万個に一個）
��DNAが機能的な状態で染色体に組み込まれる。つまり、非相同部位に組み込まれる。neor↑、tk遺伝子がともに生きている。� ↓△△錣擦特軻�した細胞の1/3〜1/5にあたる
��残りは組み込まれずにすんで、分解される
5）上の� 銑�が起こった細胞から�，世韻鯀�抜する。それには、ネオマイシン誘導体（G418）とガンシクロビル添加培地でES細胞を培養する
6）�，世韻�生き残る |
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| 2006年6月27日 (火) |
６ �〆挧Δ世韻�残る理由 |
1）ベクターが組み込まれなかった��細胞は、ベクターが分解される。neor↑も分解される。したがってG418でこの細胞は殺される
2）ベクターが非相同部位に組み込まれた細胞は、tk遺伝子が残っている。抗ヘルペス剤ガンシクロビルで、この細胞は殺されてしまう。もちろんこの細胞はG418には抵抗性をもっている
3）ベクターが染色体の相同部位に組み込まれた細胞[1万個に1個の幸運なさいぼう。培養細胞だから1万個もの細胞が扱える]は、組み込まれるときに、tk遺伝子が相同領域の外側に位置しているために、染色体に取り込まれずに脱落している
4）neor↑はもっているからG418には耐性がある。tk遺伝子がないから抗ヘルペス剤ガンシクロビルにも耐性である。そしてノックアウト遺伝子である
5）こうしてノックアウト遺伝子をもったES細胞だけが選抜された |
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| 2006年6月27日 (火) |
７ ES細胞から個体へ |
1）ターゲッティング・ベクターをもったES細胞がつくられた[ターゲッティング・ベクターは、２個ある相同染色体の片方だけに挿入されている。なぜならば、挿入の確率は10のー４乗であり、２個ともに挿入される確率は、10のー4乗×10のー4乗＝10のー8乗で、非常に低い]
2）そのES細胞[雄由来]を胚盤胞[雄由来]に注入する
3）胚盤胞を移植する。子になるものもでる
4）生まれてくるマウスの中に成体になったときにES細胞由来の精子をつくるものがいる可能性がある
5）ES精子を出すマウスを正常雌マウスと交配する
6）この正常雌マウスから、変異遺伝子をヘテロにもつ個体、つまり1対の染色地亜の一方だけ変異遺伝子をもった雌雄個体がいる
7ヘテロ雌雄個体の交配から、ホモは1/4の割合で生まれる |
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