| 2007年8月22日 (水) |
1 ニホンハタネズミの繁殖生理学的研究 |
1）WT氏の修士学位論文である
2）ニホンハタネズミの人為的繁殖のための基礎的データを得ることを目的として実験を行った
実験は三つに分けられている。一つ目は精子を培養したときの生存性、運動性を比較し、異種卵子に対する受精能を調べた
二つ目は卵子ノ培養方法と体内での発生速度ヲ調べた
三つ目は過排卵誘起方法と誘起多胎方法を検討した
3）精子について：ハタネズミ精子はマウス精子より運動性、生存性が強く長続きし、マウス、ハムスター卵子透明帯を通過した
4）ハタネズミ胚はM16培地で後期2細胞期胚からなら高率で胚盤胞まで培養でき、体内ではマウス胚より1細胞期が短く2細胞期が長いが、それ以降の発生は一致した
5）過排卵はPMSG75IU、ｈCG30IUを42時間間隔で投与したときが最も多くなり、48時間より長くすると減少した。妊娠率は50％だったが、多胎にはならなかった
6）ハタネズミ精子の異種卵子への侵入は強い運動性による。それで多精子侵入になる。2-cell blockはマウスより強く、これは2細胞期がマウスより長いためと考えられる。排卵誘起、過排卵は可能である |
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| 2007年8月26日 (日) |
2 豚体外成熟卵子の体外受精に及ぼすカフェインおよびフォルスコリンの影響 |
1）MK氏の修士論文である
2）精子のサイクリックAMPレベルを上昇させる作用のあるカフェインと、哺乳類の多様な組織でサイクリックAMPレベルを上昇させる作用のあるフォルスコリンを用いて、両者が豚の体外受精に及ぼす影響について調べた。実験によって次のような結果を得た
3）フォルスコリンはカフェインと同様に、精子の卵子への侵入を促進した
4）カフェイン、フォルスコリンを添加した培地中で精子だけを培養しても、精子の卵子への侵入能力は増加しなかった
5）カフェイン、フォルスコリンを添加した培地中で卵子だけを培養しても、卵子への精子侵入率は増加しなかった
6）カフェイン、フォルスコリンは、卵子すなわち透明帯の存在しているときにだけ、精子の卵子への侵入能力を促進した
7）精子は、カフェインあるいはフォルスコリン添加受精培地中で、媒精後2〜3時間以内に、受精能獲得・先体反応の過程を終了し、卵細胞質内に侵入できるようになった
8）カフェインは精子のサイクリックAMPレベルを30分以内に上昇させ、精子の卵子への侵入は媒精開始2〜3時間後である。フォルスコリンは精子のサイクリックAMPレベルを上昇させなかった。従ってサイクリックAMPレベルの上昇は、精子の卵子への侵入には直接の影響はないと考えられる
9）カフェイン、フォルスコリンは、精子内部へのCa2+イオンの取り込みを促進した。
10）精子の卵子への侵入に対するカフェイン、フォルスコリンの影響は、サイクリックAMPを介してというよりもCa2+イオンの取り込みを促進したことによるものと思われる |
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| 2007年8月27日 (月) |
3 マイクロインジェクション法による培養細胞への遺伝子導入法の検討 |
1）KK氏の修士論文である
2）外来遺伝子を培養細胞に導入する方法として、自動インジェクション装置AIS2（Automatic Injection system2）を用いて、培養細胞への遺伝子導入について検討した
3）AIS2を用いて培養細胞へマーカー分子を導入する際の細胞の播種形態（ゼラチンコーティングのある、なしなどの条件）、注入圧と注入時間、1回当たりにインジェクションするさいぼうを数について調べた
4）その結果、次のことが明らかになった。
�．�ラス製のカバースリップをゼラチンでコーティングし、その上に播種すると安定したインジェクションができる
��注入圧は150hPa、注入時間は0.3秒で100細胞にすると約50％の細胞へ注入できる
5）プラスミドDNAを構築し培養細胞に遺伝子を導入する条件を調べた。ゼラチンでコーティングしたカバースリップの上にNIH3T3を播種し、pGAG Luc IRES Puro、環状pCMV Luc IRES Puro、直鎖状CMV Luc IRES Puroをインジェクションした。その結果、次のことが明らかになった。
��pGAG Luc IRES Puroをインジェクションした細胞は、インジェクションしたDNA濃度が上昇するにつれて、ルシフェラーゼ活性が上昇した
��環状pCMV Luc IRES Puroを注入したさいぼうでは、60ng/ulDNAのインジェクションでルシフェラーゼ活性はプラトーに達した
�Ｄ昇疹�CMV Luc IRES Puroを注入し選択培養したところ、1、10、100ng/ulDNAの注入に対して、コロニー形成頻度はそれぞれ0.71、3.50、5.60％であった。対照として行ったリポフェクション法のコロニー形成頻度は0.006％であった
6）マイクロインジェクション法を用いた遺伝子導入法はリポフェクション法による遺伝子導入法より効率が高いことが分かった |
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| 2007年9月7日 (金) |
4 ES細胞の増殖・分化に及ぼすMEK阻害剤の影響 |
1）幹細胞は自分と同じ性質を持った細胞を産生する能力ー自己複製能ーと、機能細胞へ分化する能力ー多分化能をあわせ持った未分化な細胞である
2）幹細胞には造血幹細胞や神経幹細胞などの分化能力の限られた組織幹細胞と、個体を形成するほとんどすべての細胞に分化可能な多能性幹細胞がある
3）後者には、胚性幹細胞（embryonic stem cell、ES細胞）、胚性腫瘍細胞（embryonic carcinoma cell、EC細胞）、胚性生殖細胞（embryonic germ cell、EG細胞）がある
4）未分化性維持機構には白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor、LIF）が関与する。LIFがはたらくとき、MAPキナーゼキナーゼ（MAPKK、これをMEKと略記する）がはたらく場がある（図1-2を参照）
5）本研究は、MEK阻害剤を用いてLIFのはたらきを調べようとしたものである
6）ES細胞の未分化性のいじには、フィーダー細胞（STO細胞がよく用いられる）とLIFの使用である
7）フィーダー細胞はES細胞を培養するときの培地のようなものと考えればよさそうだ[「こもあ」の考え]。未分化状態を維持するために必要な因子を分泌している。LIFも未分化状態維持にはたらく。両者を併用することが必要である
8）LIFは二つの方向に作用する。LIFレセプターのgp130にLIFが結合すると、「図1-2」の両径路が活性化されるが、分化を抑制するSTAT3系のシグナルの強さがSHP2/MAPK系のシグナルの強さに勝るために、全体として分化抑制の効果が現れる
9）細胞にさまざまの増殖因子を添加すると、ある共通のキナーゼが活性化する。このキナーゼは増殖因子によって活性化するので、mitogen-activated protein kinaseすなわちMAPキナーゼ（MAPK）と名づけられた。図1-2のERK1/2はMAPKのファミリーである。これを活性化するにMAPKKK→MAPKK（MEK）→MAPKというカスケードがあることも分かった。PD98059、U0126はMEKに対する阻害剤である。MEKを用いてES細胞を培養したところ、PD98059ではコロニー数は有意に増加したが、U0126ではわずかに増加しただけだった。PD98059は分化誘導を抑えると考えられる
10）[MEK阻害剤を用いてES細胞の増殖・分化について理解することができることがあきらかになった] |
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| 2007年9月7日 (金) |
5 SV40T遺伝子導入によるウシ胎子脳由来株の作出と特性解明 |
1）NA氏の修士論文である
2）牛海綿状脳症などのウシの中枢神経病変の分子・細胞生物学的研究のために特性の明らかなウシ脳由来細胞株が必要である
3）液体窒素中で凍結保存したウシ胎子脳組織から脳細胞を単離して初代培養細胞となし、それらに安定した不死化細胞株を樹立すると考えられているSV40‐large T遺伝子をリポフェクション法によって導入し、不死化細胞株を樹立した
4）播種細胞数と増殖後の細胞数を比べて増加率と累積細胞集団倍加数分裂を算出した結果、集団倍加数100回以上の能力を持っていた
5）長期間凍結保存されたウシ小脳組織を材料に用いた場合でも、脳細胞の初代培養が可能で、それにSV40‐large T遺伝子を導入することによってウシ胎子脳由来の不死化細胞株が作出できた
6）細胞株に対して、細胞形態、免疫染色特性、血管様構造形成能力などを調べた結果、不死化された細胞株は血管内皮様の性質を持っていることが明らかとなった
7）今回の培養条件では、血管内皮の性質を持っている細胞の増殖がほかのタイプの細胞より活発であったため、SV40‐large T遺伝子が効率よく導入されたために単離されたものと考えられる
8）発生段階の異なるウシ胎子脳組織を利用するなどによって、ほかのタイプの不死化細胞株も得られるのではないかと考えられる
9）今回得られた不死化細胞にBSEプリオンを感染させ、インビトロ培養系でプリオンが増殖するような持続感染株を樹立することが、今後の研究の展開として考えられる |
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| 2007年9月9日 (日) |
6 マウスにおける過剰排卵の系統差 |
1）WT氏の卒論である
2）PMSGとｈCGの連続投与により2系統のマウスC57BKL/6jとC3H/HeNに過剰排卵を誘起し、排卵数の系統差、胚発生の進行、胚の同系移植と異系移植について調べた
3）排卵数は、C57BKL/6jが25.4個、C3H/HeNが23.6個で、前者の方が多い傾向にあった
4）胚の発生は、排卵3日目はC3H/HeNの方が先に桑実期胚に達するが、4日目にはC57BKL/6jの方が先に胚盤胞に進む傾向があった
5）同系移植と異系移植については、異系移植の方が分娩率が高い傾向にあった |
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